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[求助]
cDNA-AFLP 預(yù)擴非彌散
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我在做cDNA-AFLP，出現(xiàn)如下問題，請教各位大俠： 在酶切連接后直接預(yù)擴，電泳圖非彌散狀態(tài)，而是有幾條特異條帶。見附件 RNA提取采用的艾德萊RNA提取試劑盒，并用TakaRa公司的雙鏈合成試劑盒（D6130）合成 cDNA雙鏈，用氯仿抽提純化。而后進行酶切連接，體系如下： T4 Buffer：2ul EcoR I接頭(5pmol/ul)：0.8ul Mse I接頭(50pmol/ul)：0.8ul cDNA:4ul T4連接酶:0.3ul EcoR I:0.2ul Mse I:0.4ul 加dd H2O至20ul 37℃過夜。后進行預(yù)擴。 自己的分析： 1、可能為酶切連接過程出現(xiàn)問題。但以DNA為對照進行實驗，該體系應(yīng)該不存在問題。 2、考慮為cDNA的問題。個人也覺得通過氯仿抽提后cDNA純度可能存在問題，但一是沒有更好的方法，二是覺得cDNA不純會使酶切不充分，但不致影響這么大吧。 3、可能為合成的cDNA即出現(xiàn)問題。RNA提取質(zhì)量不算好，勉強能用，cDNA電泳發(fā)現(xiàn)條帶較小，但呈彌散狀。另外請教，我在合成cDNA第二鏈時，使用PCR 16℃ 2小時一步打開了熱蓋；在最后一步說明書讓加EDTA和SDS終止反應(yīng)，我只加了SDS，是否會有影響？ 請各位大俠指教，萬分感謝。 預(yù)擴1.jpg 預(yù)擴2.jpg 預(yù)擴3.jpg cDNA圖.jpg |
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