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liangjuan2007銅蟲 (小有名氣)
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雙抗體夾心ELISA的梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)結(jié)果確無梯度變化，真心求大家?guī)兔Ψ治鲈颍?
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最近做雙抗體夾心ELISA，一抗二抗用的都是進(jìn)口的，之前做WB試驗(yàn)的，標(biāo)準(zhǔn)品是sigma公司的凍干粉，買回來自己配的不同的梯度濃度，最后標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻沒有梯度變化，數(shù)據(jù)幾乎完全一樣，到底是為什么��！ 我配置的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度如下：(U/L) 200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、 相應(yīng)的OD值結(jié)果：2.564、2.617、2.719、2.657、2.712、2.835、2.646、 空白孔的值也大的嚇人，為:2.697. 做了好多次結(jié)果都是這樣，一抗稀釋度做過1:2000、1:4000、1:6000，二抗做過1:4000、1:8000、1:16000的，完全沒有梯度，這是為什么啊為什么啊？ 我具體的實(shí)驗(yàn)步驟如下： (1)包被：用包被緩沖液將一抗稀釋成一定濃度。在酶標(biāo)板反應(yīng)孔中加0.1 mL，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。 (2)封閉：封閉液（5%的脫脂奶粉）每孔0.2ml，37℃，2h后洗滌。（嘗試過封閉和不封閉的，結(jié)果沒有差別） (3)加樣：加一定濃度稀釋（封閉液稀釋）的標(biāo)準(zhǔn)品溶液(同時(shí)做空白對(duì)照)0.1 mL 于上述已包被的反應(yīng)孔中，37℃， 1 hr。用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。 (4)加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（封閉液稀釋）0.1ml。37℃，0.5 - 1 hr，用洗滌緩沖液洗板6 次，每次3 min。（怕洗不干凈，加倍次數(shù)，據(jù)說這步的洗滌很重要！） (5)加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入現(xiàn)配的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃，10 - 30min。（TMB用的是生工的粉末，然后自己配的） (6)終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入終止液0.05 mL。 (7)結(jié)果判定：將酶標(biāo)板在酶標(biāo)儀上，于450 nm讀數(shù)。 都快抑郁了，跪求各位前輩給點(diǎn)意見吧！ |
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看完你的結(jié)果后，首先感覺空白結(jié)果很奇怪，按道理，它是不應(yīng)該出現(xiàn)顏色的，但是現(xiàn)在，他的結(jié)果和你梯度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果無差異，由此分析，我覺得問題最大的可能性是出在TMB上，你可以試著檢查一下TMB是否有問題，或者用一些商品化的TMB。第二個(gè)感覺可能有問題的是洗液，只有此兩項(xiàng)影響你的整個(gè)實(shí)驗(yàn)，導(dǎo)致可能出現(xiàn)問題；以上是我的建議，希望對(duì)你有幫助。呵呵！祝你實(shí)驗(yàn)順利。 |
4樓2013-02-26 11:27:52
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空白是一抗二抗都有的，但沒有加抗原；我嘗試過不包被一抗且不加標(biāo)準(zhǔn)品抗原的，只加二抗的，它的OD值就只有0.04了！跟干凈的孔（沒做試驗(yàn)的）讀數(shù)一樣。 二抗的稀釋度做過不一樣的，結(jié)果沒有大差別，難道是稀釋度還不夠？感覺已經(jīng)很大了，都到1:16000了？ 做過只加二抗，它的OD值就只有0.04，那TMB就無問題，洗液也無問題，那可能性就出在酶標(biāo)二抗可能被吸附產(chǎn)生的結(jié)果了，你把稀釋液更換一下，別用封閉液稀釋，換用血清或白蛋白（BSA）做稀釋液試一下。呵呵  |
7樓2013-02-27 09:24:02
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