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consist10金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
求助GST純化，凝血酶酶切！謝謝
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用pGEX-4T-1載體表達(dá)HPV18 L1蛋白，為可溶性表達(dá)。由于菌體上清中有分子伴侶GroEL存在，在進(jìn)行GST純化前，先后加入ATP, MgCl2，KCL，20%甘油和3.5M尿素去除伴侶，13000rpm，4度離心。將菌體上清直接進(jìn)行GST純化，用含有3mM DTT，0.2M Nacl，1mM EDTA的50 mM Tris pH 8.0溶液洗去雜蛋白后， 用含有75mM還原型谷胱甘肽，0.1M Nacl的50mM Tirs（pH9.0）洗脫HPV18 L1-GST融合蛋白�？次墨I(xiàn)中有在凝血酶中加入0.1-0.2M Nacl和2.5mM 氯化鈣增加酶活性的，于是將洗脫產(chǎn)物用含有這兩種成分的20 mM Tris pH 8.4溶液進(jìn)行4度透析，在透析6-10小時(shí)左右發(fā)現(xiàn)有融合蛋白沉淀析出，請(qǐng)教大家我的實(shí)驗(yàn)操作存在什么問(wèn)題。該如何進(jìn)行凝血酶酶切切去GST標(biāo)簽，酶切體系是什么？酶切時(shí)要注意什么問(wèn)題？如何保存GST純化的融合蛋白產(chǎn)物？ 另外，我也嘗試了將菌體上清液掛在GST樹(shù)脂上，用50 mM Tris pH 8.0 洗去雜蛋白，然后加入3.5mL 凝血酶（用25mM Tris pH8.0溶解，濃度為20 U/mL）。在凝血酶完全進(jìn)入GST樹(shù)脂后，4度靜止作用20小時(shí)，接著用Tris洗脫柱子，洗出來(lái)的是凝血酶。最后用還原型谷胱甘肽洗脫柱子，洗出來(lái)的是HPV18 L1-GST融合蛋白，也含有少量凝血酶。凝血酶柱上酶切的失敗原因是什么。文獻(xiàn)中有用25mM Tris pH9.0溶解凝血酶，然后進(jìn)行酶切的，這樣可行嗎？另外， GST純化時(shí)，均是4度循環(huán)上樣3小時(shí)，但掛柱效率仍然不高，如何提高掛柱效率呢？由于急于畢業(yè)，實(shí)驗(yàn)遇到這個(gè)難題，十分著急。希望大家給予指教，十分謝謝！ PS：混數(shù)要金幣的請(qǐng)繞行！ |
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consist10
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6樓2019-11-26 23:20:21
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