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RACE原理真誠求指教
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看了好幾個版本的3`和5`RACE原理，還是很迷惑，求達(dá)人指點 還是搞不清楚幾個問題， 1、所說的末端未知序列到底是那一段序列，比如說3`RACE，說是該末端有個ploy（A）尾巴，未知序列指的就是尾巴前面的一段序列？而mRNA通常不都是已知的嗎，還擴增這末端？什么情況下未知呢？ 2、下圖所訴原理，中搞不懂為什么設(shè)計最上面那3個錨定引物，有的地方稱內(nèi)外側(cè)引物，若說上面我描述的未知末端位置是對的，那下面圖中一直用一個基因特異性引物和一個錨定引物進(jìn)行幾輪PCR，不可以嗎？ 3、5`末端指哪里呢，原理也不清楚呀？ 未命名.jpg [ Last edited by qwky2010 on 2013-3-6 at 11:07 ] |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
qwky2010: 金幣+10, ★★★★★最佳答案, 真誠感激您細(xì)心講解， 2013-03-06 13:20:43
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關(guān)于RACE的方法，是有來歷的。在很多的實驗里面，比如cDNA文庫的構(gòu)建、同源克隆等，獲得的cDNA片段通常都是部分的，而cDNA的兩個末端是未知的，也就是5'末端和3'末端，末端難以克隆是因為PCR技術(shù)的局限性，PCR要克隆一個片段，必須是片段兩端已知，才能設(shè)計引物，然后進(jìn)行克隆。而cDNA末端是未知的，所以有一條引物是不能設(shè)計的，這樣就不能很方便的克隆全長cDNA，也許RACE技術(shù)就相應(yīng)誕生了。所有的RACE的原理不外乎是把未知末端變成已知末端，然后就可以用PCR的技術(shù)克隆出來了。包括樓主圖示的原理，就是加了已知接頭，在接頭上設(shè)計引物，和內(nèi)部已知序列上的基因特異引物配對就完成了克隆。此外還有其他技術(shù)，如反向PCR，SMART RACE等。 看你的圖示原理，沒有詳細(xì)的文字說明比較難懂。尤其是圖上的“第一鏈擴增”“第二鏈擴增”這種稱謂感覺不妥。寫成“第一次PCR”和“第二次PCR”感覺還行。 你的圖示原理是利用反轉(zhuǎn)錄過程中加接頭的方式，然后通過巢式PCR來進(jìn)行的RACE，巢式PCR可以提高RACE的成功率。 A圖是設(shè)計的接頭，接頭名字叫QT，它不是很長，估計也就60-70bp吧，中間涉及上了酶切位點，便于后續(xù)操作，QT的3'端是多聚T,在QT上游設(shè)計了兩個引物：Q0和Q1，Q0是外側(cè)引物，Q1是內(nèi)側(cè)引物，分別用于巢式PCR的第一次和第二次PCR擴增。 B圖，是3' RACE應(yīng)該比較好理解。使用QT為反轉(zhuǎn)錄引物直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，因為QT的3端是多聚T，所以可以和mRNA的3'的polyA結(jié)合，這樣反轉(zhuǎn)錄后cDNA的3'末端就加上了QT接頭，然后根據(jù)特異基因序列設(shè)計基因特異性引物GSP1和GSP2，Q0和GSP1進(jìn)行第一次PCR，Q1和QGSP2進(jìn)行第二次PCR，最終能夠獲得3 RACE產(chǎn)物。該方法具有通用性，而且成功率很高。 C圖 是5'RACE原理，稍微復(fù)雜一點，根據(jù)基因序列設(shè)計GSP-RT引物為反轉(zhuǎn)錄引物，使用它可以把目標(biāo)基因反轉(zhuǎn)錄出來得到cDNA，但是因為沒有多聚A，所以不能加上QT接頭。圖中加入了一步cDNA加尾目的就是能夠利用QT，加尾之后，第一次PCR（也就是第一鏈擴增）使用QT和Q0與GSP1三條引物共同進(jìn)行擴增，這樣就變相的把QT加到了cDNA的5'末端。然后用Q1和GSP2進(jìn)行第二次PCR，最后能獲得5 RACE產(chǎn)物。值得注意的是，針對同一個基因，B圖中的GSP1和GSP2與C圖中的GSP1和GSP2是不一樣的，需要分別設(shè)計。 此外，這個原理中的5'RACE雖然有針對性，但它是麻煩的，麻煩在于每個基因需要多設(shè)計一條基因特異性的反轉(zhuǎn)錄引物GSP-RT，因此反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物沒有通用性�，F(xiàn)在可能多用基于SMART技術(shù)的RACE方法，比較便利。 |
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qwky20102樓2013-03-06 12:28:23
3樓2013-03-06 13:21:13
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