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chenhw06

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[交流] HPLC 流動(dòng)相的操作

請(qǐng)問(wèn)大家，HPLC流動(dòng)相是4：1的乙腈和水。之前都是先混合再過(guò)濾超聲到一個(gè)瓶子，這次想省事，就分別過(guò)濾用兩個(gè)瓶子裝著，然后將設(shè)置A（乙腈）管道80%，B（水）管道20%，混合。（兩者混合的時(shí)候應(yīng)該會(huì)產(chǎn)生起泡，對(duì)柱子什么有沒(méi)有影響？）你們一般都是怎么做的吶？

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2樓: Originally posted by BUU-2011 at 2013-04-02 07:42:05
如果使用前乙腈和水都超聲脫氣了，這樣做是沒(méi)有問(wèn)題的，不過(guò)不知道你是哪個(gè)型號(hào)的機(jī)子，最好把機(jī)子的在線脫氣提前打開(kāi)，in case。

使用前都超聲了，用的是Waters 2695.在線脫氣一直都是開(kāi)著的。不過(guò)的色譜圖不知道怎么回事是這樣的？是純品，準(zhǔn)備做標(biāo)曲的，這個(gè)到底是什么情況啊？

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4樓2013-04-02 09:40:23

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3樓: Originally posted by wy1518 at 2013-04-02 07:45:33
你的儀器有在線脫氣機(jī)嗎？有的話就不用擔(dān)心沒(méi)有的話還是要分別脫氣減少混合時(shí)的氣泡量另外流動(dòng)相不要放在溫度高的地方和陽(yáng)光直射的地方

流動(dòng)相就放在分離系統(tǒng)的上面，溫度就是室溫吧，大概20多度�？梢詥�？

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6樓2013-04-02 09:42:47

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5樓: Originally posted by akosrios at 2013-04-02 09:42:37
這種操作沒(méi)有什么問(wèn)題。色譜圖是哪樣的？

色譜圖很有問(wèn)題啊，配的純?nèi)芤海译孀鋈軇＞褪沁@樣的，不知道是什么問(wèn)題？

2.png

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7樓2013-04-02 09:44:13

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忘記附圖了，就是下面那個(gè)。

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8樓2013-04-02 09:45:06

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9樓: Originally posted by akosrios at 2013-04-02 09:51:40
用的什么色譜柱

如果是反相柱，80%的乙腈洗脫太強(qiáng)，從圖上看樓主的物質(zhì)幾乎沒(méi)有保留，適當(dāng)降低乙腈比例，或者使用梯度洗脫

另外，盡量用流動(dòng)相或者水相溶解樣品，不要用純乙腈，容易有溶劑效應(yīng)影響峰型...

用的C8柱，因?yàn)槿苜|(zhì)不溶于水，所以用純乙腈溶的。乙腈跟水的配比是在小木蟲(chóng)上查的，因?yàn)闆](méi)有文獻(xiàn)提到。我現(xiàn)在去調(diào)成3：1和2:1試一下。不過(guò)不用流動(dòng)相溶解樣品應(yīng)該沒(méi)有很大問(wèn)題吧?因?yàn)槲仪懊孀龅囊慌鷮?shí)驗(yàn)都是用乙腈定容的，現(xiàn)在要是改成流動(dòng)相，樣品檢測(cè)就木辦法了。

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10樓2013-04-02 10:00:24

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11樓: Originally posted by huangq816 at 2013-04-02 10:22:19
很可能是溶劑效應(yīng)，減少進(jìn)樣量，或者用初始比例的流動(dòng)相當(dāng)成稀釋液。

我的進(jìn)樣量是10微升，這個(gè)大嗎？稀釋液我看的文獻(xiàn)他們都是用的純乙腈，而且我樣品是這樣處理保存的，所以實(shí)不到萬(wàn)不得已我不想改變啊。

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12樓2013-04-02 10:25:53

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13樓: Originally posted by zhangyun3235 at 2013-04-02 10:31:59
溶質(zhì)一點(diǎn)都不溶于水嗎？

對(duì)啊，我試過(guò)配0.01 mg/mL的溶液，不溶，加熱到60℃，才溶一部分。

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14樓2013-04-02 10:37:19

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17樓: Originally posted by liuyue369 at 2013-04-02 10:43:55
祝福

親，少領(lǐng)點(diǎn)金幣撒

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18樓2013-04-02 10:53:48

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19樓: Originally posted by zhangyun3235 at 2013-04-02 11:50:41
是不是柱子被污染了啊...

木有，新柱用了沒(méi)幾次。剛才看了下，好像確實(shí)是流動(dòng)相配比有問(wèn)題，用3:1和2：1試了下好像可以了。

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20樓2013-04-02 12:13:48

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21樓: Originally posted by ying_cheng at 2013-04-02 12:26:14
先做一個(gè)溶劑的空白對(duì)比一下吧，看是不是溶劑引起的
如果這個(gè)峰是你的目標(biāo)物，那保留也太弱了，峰型也不對(duì)，目前的這個(gè)流動(dòng)相體系可能不合適，如果是反相柱的話，乙腈含量太高了。

用的反相柱，應(yīng)該是乙腈含量太高了。后面降低了跑了一下，好了很多。就是吸收比較大的210 nm峰形不尖，峰頭有點(diǎn)寬？不過(guò)還好278 nm峰形還不錯(cuò)。

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22樓2013-04-02 12:38:24

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23樓: Originally posted by 724849361 at 2013-04-02 14:33:37
乙腈比例太大了……反正我們是很少用如此大比例的乙腈。色譜條件還是自己摸索出來(lái)的好，別人的只能作為參考，畢竟不同的機(jī)器、不同的柱子響應(yīng)是不同的。

確實(shí)是大了，降低了后就好了。

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26樓2013-04-02 15:33:17

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24樓: Originally posted by hua132201146 at 2013-04-02 15:15:31
1.如果懷疑混合的時(shí)候產(chǎn)生氣泡，那么可以查看壓力線，管路系統(tǒng)中如果進(jìn)氣泡的話，在壓力線會(huì)有所體現(xiàn)的；
2.色譜峰形差，并且樣品為純品，大致可以認(rèn)為是乙腈的溶劑峰引起的，采集波長(zhǎng)應(yīng)該是低于220nm的。
建議： ...

流動(dòng)相我最后采用2：1，做出來(lái)標(biāo)曲還可以。采集波長(zhǎng)應(yīng)該低于220 nm是什么意思吶？

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28樓2013-04-02 15:48:51

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25樓: Originally posted by bomblei at 2013-04-02 15:30:23
多做幾次就好了，這個(gè)需要摸條件的。加油

謝謝謝謝

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29樓2013-04-02 15:49:13

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27樓: Originally posted by huangq816 at 2013-04-02 15:42:01
那你試試5uL看看，如果還是這樣，就可以排除溶劑效應(yīng)，從其他方面找找原因。...

嗯啊，我試一下哈。

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30樓2013-04-02 15:50:26

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31樓: Originally posted by libaoguo at 2013-04-03 15:17:20
主要看泵的型號(hào)了如果是2元高壓泵就不會(huì)有問(wèn)題

我們的是四元梯度泵，配有真空脫氣機(jī)，沒(méi)問(wèn)題吧

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32樓2013-04-03 15:37:49

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您幫忙看一下譜圖吧，這個(gè)是用乙腈和水2：1做流動(dòng)相測(cè)的，乙腈為溶劑，最后標(biāo)曲R2=0.9968（278 nm ）。①標(biāo)樣在210 nm吸收比較大，但是峰行不好，下面是1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.3 mg/mL、0.1 mg/mL時(shí)候的峰，1和0.5峰頭比較圓，這是不是濃度比較大的原因？0.3峰還好，0.1峰前伸，這個(gè)是因?yàn)槭裁�？（乙腈為溶劑產(chǎn)生的？）②278 nm的時(shí)候吸收較弱，但1 mg/mL~0.3 mg/mL峰形都蠻好，不過(guò)0.1 mg/mL峰前伸，這是因?yàn)槭裁茨�？這個(gè)測(cè)的標(biāo)曲可以用嗎？請(qǐng)您指點(diǎn)啊。

1mg/mL（210nm）.png

0.5mg/mL（210nm）.png

0.3mg/mL（210nm）.png

0.1mg/mL（210nm）.png

1mg/mL（278nm）.png

0.3mg/mL（278nm）.png

0.1mg/mL（278nm）.png

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34樓2013-04-03 16:50:23

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33樓: Originally posted by libaoguo at 2013-04-03 16:23:26
四元梯度泵就是低壓的了，效果沒(méi)有二元的好。我用四元泵走過(guò)甲醇-水，沒(méi)有問(wèn)題，你這個(gè)開(kāi)了真空脫氣，應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題。你柱溫不高吧？...

柱溫是30℃，我剛才在網(wǎng)上看了一下四元泵的圖，看到是下脫氣后按比例混合，這點(diǎn)不明白，脫氣之后混合不會(huì)又產(chǎn)生起泡了嗎？如果是有機(jī)相跟水混合。

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35樓2013-04-03 16:53:42

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37樓: Originally posted by swallow13 at 2013-04-03 17:46:07
lz用的是Waters e2695的泵吧？只要在線脫氣正常在線混合是沒(méi)有問(wèn)題的我有一個(gè)樣品是走乙腈50→95的梯度運(yùn)行正常...

確實(shí)是Waters 2695，混合沒(méi)問(wèn)題就好

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38樓2013-04-03 18:40:51

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36樓: Originally posted by swallow13 at 2013-04-03 17:44:44
從譜圖來(lái)看 1mg/ml和0.5mg/ml濃度顯然大了 0.1和0.3mg/ml濃度的峰都有一點(diǎn)峰前伸只是0.1的峰放大倍數(shù)多一點(diǎn) 所以看起來(lái)比較明顯建議lz將不對(duì)稱度等參數(shù)也一并貼上來(lái) 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇不一定要選擇最大吸收波長(zhǎng) 但要 ...

說(shuō)的太專業(yè)了，聽(tīng)的云里霧里啊。不對(duì)稱度、理論塔板是要自己算出來(lái)嗎

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40樓2013-04-03 19:31:19

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39樓: Originally posted by 1229240180 at 2013-04-03 19:19:18
應(yīng)該會(huì)有一定影響！

。。。。。決定以后混合好再過(guò)濾

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41樓2013-04-03 19:32:49

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42樓: Originally posted by yugijiang at 2013-04-04 14:40:34
這可能是你的洗脫強(qiáng)度太大了，試試調(diào)節(jié)下比例吧，還有確認(rèn)下色譜柱的性能

最后調(diào)到了2：1，基本是是沒(méi)問(wèn)題，就是幾個(gè)濃度峰形有點(diǎn)前伸。C8柱剛用了幾次，性能應(yīng)該還好吧。

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43樓2013-04-05 10:53:14

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chenhw06

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44樓: Originally posted by swt1898 at 2013-04-06 10:58:06
液相就要多摸索

是啊，可是我的重點(diǎn)不是液相呀

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回復(fù)此樓

46樓2013-04-06 11:07:20

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