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gissingtan

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4樓: Originally posted by q317476148 at 2013-04-03 18:13:02
你用多少微升體系？以前我用50的老做不出來(lái)，要么各種雜帶。換成25的就好做多了。

用的也是25 以前用50 也是p不出來(lái)

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11樓2013-04-05 12:25:56

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6樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-04 02:56:53
PCR沒(méi)做出來(lái)。對(duì)提取的DNA模板是否消化了RNA，用了多少模板？

用了1μl ，這次提的DNA濃度很低，第一天下午提好的，第二天早上檢測(cè)的，做了一天pcr總是出問(wèn)題，晚上再次電泳檢測(cè)DNA時(shí)發(fā)現(xiàn)DNA都降解了，以前都沒(méi)出現(xiàn)過(guò)這樣的問(wèn)題，請(qǐng)問(wèn)是怎么回事

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12樓2013-04-05 12:29:46

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7樓: Originally posted by chenguestc at 2013-04-04 07:56:31
擴(kuò)增彌散，說(shuō)明，模板太多或者退火溫度太低，或者引物不特異，請(qǐng)根據(jù)情況，減少模板用量，提高退火溫度試試，如果不行就換引物，每次試驗(yàn)盡量加上陰陽(yáng)對(duì)照否則不好分析。。。。。。

恩，設(shè)計(jì)的引物特異性不太高。這次提的DNA濃度很低，第一天下午提好的，第二天早上檢測(cè)的，做了一天pcr總是出問(wèn)題，晚上再次電泳檢測(cè)DNA時(shí)發(fā)現(xiàn)DNA都降解了，以前都沒(méi)出現(xiàn)過(guò)這樣的問(wèn)題，請(qǐng)問(wèn)是怎么回事

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13樓2013-04-05 12:31:07

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8樓: Originally posted by auroraA at 2013-04-04 15:28:59
除非你的primer有問(wèn)題,或者DNA template 不好,否則看樣子就一條路,你就漲annealing temperature吧,而且還要漲不少. template不要加多了,越多約不好.PCR很靈敏,條件合適的話,槍尖上沾點(diǎn),都不用有準(zhǔn)確體積就夠了

謝謝~

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14樓2013-04-05 12:31:33

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9樓: Originally posted by yangcongcong at 2013-04-05 09:06:07
1.DNA質(zhì)量不行 2.反應(yīng)體系很不合理 3循環(huán)數(shù)減少10次
人工提DNA很可能是1，要是試劑盒那就2了，可能性很多，一步步聯(lián)系吧，很正常

怎么才能提高DNA質(zhì)量呢？

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15樓2013-04-05 12:32:07

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-04-27 21:23:36

實(shí)驗(yàn)好像是：先提取基因組DNA，再以此為模板，進(jìn)行PCR的操作。
個(gè)人建議：一步一步的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。
首先,基因組DNA的提取，個(gè)人建議你做一個(gè)濃度低一點(diǎn)的瓊脂糖膠，爭(zhēng)取能讓基因組能夠跑出孔，以便與確認(rèn)基因組的提取效果。個(gè)人感覺(jué)，你的提取結(jié)果不算好，有雜帶。同時(shí)，PCR的結(jié)果不特異，也應(yīng)該反思第一步的實(shí)驗(yàn)。個(gè)人建議，用好的基因組提取試劑盒再試一試。

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16樓2013-04-05 15:00:23

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【答案】應(yīng)助回帖

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12樓: Originally posted by gissingtan at 2013-04-05 12:29:46
用了1μl ，這次提的DNA濃度很低，第一天下午提好的，第二天早上檢測(cè)的，做了一天pcr總是出問(wèn)題，晚上再次電泳檢測(cè)DNA時(shí)發(fā)現(xiàn)DNA都降解了，以前都沒(méi)出現(xiàn)過(guò)這樣的問(wèn)題，請(qǐng)問(wèn)是怎么回事...

DNA一般比較穩(wěn)定，提出的DNA降解的可能性不是很高，除非你加DNase消化。你確定提的DNA沒(méi)有問(wèn)題嗎？提取的DNA濃度大約多少？

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17樓2013-04-05 23:40:04

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gissingtan: 金幣+1, ★★★很有幫助 2013-04-06 19:59:27
gissingtan: 金幣+1, ★★★很有幫助 2013-04-07 17:34:30

1、你提取的基因組DNA質(zhì)量不是很好，我們用CTAB法或SDS法提�。ǹ杉尤隦Nase A進(jìn)行消化RNA）的DNA質(zhì)量都很好�。∣D260/OD280在1.7-1.9之間，OD260/OD230大于2）另外提取基因組DNA的電泳膠圖條帶要清晰單一，沒(méi)有降解，就像你跑Lamda DNA一樣；另外，我覺(jué)得你提取的DNA樣品中，含有大量的蛋白、多糖等雜質(zhì)，沒(méi)有用酚氯仿異戊醇萃取干凈；
2、做PCR時(shí)，反應(yīng)體系中，DNA的濃度最好在50-150ng/ul時(shí)，加0.5-1.5ul；另外，看看你設(shè)計(jì)引物的退火溫度在多少（可以做一個(gè)梯度PCR找到合適的退火溫度），預(yù)期目的片段大小是多少，以期設(shè)定退火溫度和延伸時(shí)間；
3、看看你的膠孔有沒(méi)有漏，還有就是瓊脂糖膠均一不均一；
4、電泳的場(chǎng)壓在3.5-8V/cm之間；
最后，希望你能找到原因，試驗(yàn)順利！

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18樓2013-04-06 01:08:55

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17樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-05 23:40:04
DNA一般比較穩(wěn)定，提出的DNA降解的可能性不是很高，除非你加DNase消化。你確定提的DNA沒(méi)有問(wèn)題嗎？提取的DNA濃度大約多少？...

圖上的DNA是第一天下午提出來(lái)的，膠是第二天早上跑的，白天做了一天PCR都沒(méi)有結(jié)果，所以晚上再次檢測(cè)了一下DNA,發(fā)現(xiàn)都沒(méi)有DNA了。圖中marker 的條帶應(yīng)該是30nk。

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19樓2013-04-06 19:53:27

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18樓: Originally posted by tcgpinder at 2013-04-06 01:08:55
1、你提取的基因組DNA質(zhì)量不是很好，我們用CTAB法或SDS法提�。ǹ杉尤隦Nase A進(jìn)行消化RNA）的DNA質(zhì)量都很好�。∣D260/OD280在1.7-1.9之間，OD260/OD230大于2）另外提取基因組DNA的電泳膠圖條帶要清晰單一，沒(méi)有降解 ...

每次提的DNA結(jié)果都很不穩(wěn)定，有時(shí)碎片很多，有時(shí)量很少。最郁悶的是它不到一天就降解了，找不到原因。

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20樓2013-04-06 20:01:11

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