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[求助]
一步RT-PRC后樣品卡在凝膠孔了
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提細(xì)胞總RNA，跑出三條帶了，第一條比第二條亮一倍多。 然后RT-PCR用特異性引物做，陽性對照，陰性對照，實驗組都沒有東西，marker出來了。那三組凝膠孔發(fā)亮。 我加的模板是3微，由于沒機(jī)會測濃度和OD260/280，第一次做的時候加了5微，也是一樣的效果。 由于引物除了互補(bǔ)區(qū)外還加了酶切位點和保護(hù)堿基，就逆轉(zhuǎn)錄過后5個循環(huán)是不算酶切位點的退火溫度，剩下做了25個循環(huán)是按照全長引物算的，大概提高了7度。 由于內(nèi)參也沒有做出來，我很是抑郁。 想知道，是不是就是因為我沒有測純度和濃度造成的。但是我跑總RNA的時候條帶除了28s的兩側(cè)有一點拖尾，另外兩條都很好，亮度也不錯。 PS，如果我引物不是完全互補(bǔ)的，是不是會造成PCR的難度捏。那我是不是應(yīng)該用兩步RTPCR比較好？ 拜托大神們了！ rtpcr.jpg 總RNA.jpg |
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2樓2013-04-07 00:04:14
15樓2013-04-08 22:22:10
mitocam
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3樓2013-04-07 01:08:04
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6樓2013-04-07 10:18:27
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【答案】應(yīng)助回帖
★
xjtu0025: 金幣+1, ★有幫助 2013-04-07 21:52:23
xjtu0025: 金幣+1, ★有幫助 2013-04-07 21:52:23
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Trizol 吹打，目的只是讓細(xì)胞完全裂解，所以時間不是衡量的標(biāo)準(zhǔn)，這是彈性的，能看到明顯的細(xì)胞碎片就行，我們實驗室是用plate，所以相對來說更方便些，樓主，很可能是提RNA的過程中出了問題，至于一步法PCR我還沒做過，是不是加了特殊的酶，會不會對結(jié)果有影響。樓主說加了溴酚蘭后有沉淀，這肯定是出了問題，提RNA最后一步干燥太久可能會出現(xiàn)這樣的問題，RNA或DNA難溶于水，我曾經(jīng)碰到這樣的問題，樓主可以試試離心后用移液槍吸干后晾一會兒加水溶解。  |
7樓2013-04-07 11:50:48
8樓2013-04-07 21:46:33
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溴酚藍(lán)不是我加的，是PCRmix里面本身有的。南京凱基的一步氏試劑盒。 2×RT-PCR Mix 25μL M-MLV/Taq Mix 1.5 μL RNase抑制劑(40u/μL) 0.5 μL 2~5μg RNA n μL 引物I (10μM) 1 μL 引物II (10μM) 1 μL 無核酸酶的雙蒸水至總體積 50μL 我是按照順序加的，那個mix就是藍(lán)色的。 一步法就是把taq和MMLV混在一起了。 我沒有干燥很久，我最后一步傾倒出乙醇后，就用移液器吸掉EP管口的最后一滴，然后直接加40ul處理好的水。 我現(xiàn)在的狀態(tài)時連里面的內(nèi)參都沒有結(jié)果，上樣孔很亮。 覺得很奇怪，我的RNA跑出來條帶挺完整的。我今天又提了一次，6個樣品，都是標(biāo)準(zhǔn)的3個帶，28s兩倍亮于18s，5s淺。 |
9樓2013-04-07 21:52:13
10樓2013-04-07 21:53:48
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