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holyala木蟲(chóng) (著名寫手)
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[轉(zhuǎn)帖]PCR技術(shù)三十周年紀(jì) 已有6人參與
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PCR技術(shù)三十周年紀(jì) http://seq.cn/309--1 上世紀(jì)八十年代Cetus Corporation公司的化學(xué)家Kary Mullis發(fā)明了PCR，如今DNA擴(kuò)增儼然已經(jīng)成為了生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。今年正值PCR技術(shù)誕生三十周年，讓我們看看如今的PCR是個(gè)什么模樣。 三十年來(lái)，人們?yōu)榱私鉀Q研究中出現(xiàn)的新問(wèn)題新需求，不斷對(duì)這一經(jīng)典技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，催生出了越來(lái)越多的新研究工具。如今PCR技術(shù)早已走出實(shí)驗(yàn)室，在遺傳學(xué)鑒定和疾病診斷中發(fā)揮著巨大的作用，在越來(lái)越廣闊的領(lǐng)域里煥發(fā)著新的活力。 高保真酶 PCR技術(shù)長(zhǎng)盛不衰的秘訣之一就是，以模板為基礎(chǔ)合成新鏈的DNA聚合酶一直在不斷地發(fā)展�！白訮CR技術(shù)誕生以來(lái)，PCR的進(jìn)步很大程度上依賴于酶學(xué)的發(fā)展，”Thermo Scientific的產(chǎn)品經(jīng)理Edita Smergeliene說(shuō)�，F(xiàn)在我們已經(jīng)難以想象，沒(méi)有自動(dòng)化PCR儀也沒(méi)有熱穩(wěn)定聚合酶的原始PCR實(shí)驗(yàn)。當(dāng)年的研究人員得親手控制樣品溫度，將新鮮的DNA聚合酶添加到每個(gè)循環(huán)中。從源自E. coli的原始DNA聚合酶，到更耐熱但易出錯(cuò)的Taq酶（源于Thermus aquaticus），再到不易出錯(cuò)的校讀型DNA聚合酶，人們?cè)诓粩喔脑熘鳳CR酶以滿足日益增長(zhǎng)的特殊需求。 如今“高保真”DNA聚合酶設(shè)計(jì)得更為精益求精。例如Thermo Scientific公司的Phusion高保真DNA聚合酶，將具有校讀功能的古細(xì)菌酶與耐熱的DNA結(jié)合蛋白融合在一起�！斑@種結(jié)合蛋白能增強(qiáng)聚合酶與雙鏈DNA的親和力，”Smergeliene說(shuō)�！癙husion的強(qiáng)勁性能及其高超的持續(xù)合成能力，使其特別耐受PCR抑制劑，可以在標(biāo)準(zhǔn)聚合酶無(wú)能為力時(shí)大顯身手�！盓MD Millipore公司的KOD高保真DNA聚合酶特別適用于PCR的新應(yīng)用領(lǐng)域，例如二代測(cè)序（NGS）和生物學(xué)合成等�！拔覀兊腜ureGenome™ 二代測(cè)序試劑盒就采用了KOD 高保真DNA聚合酶，能夠有效降低NGS文庫(kù)制備中的偏好。對(duì)于以PCR為基礎(chǔ)的高通量測(cè)序來(lái)說(shuō)，偏好性是一個(gè)很普遍的問(wèn)題，”EMD Millipore公司的基因組產(chǎn)品經(jīng)理Ayaz Majid說(shuō)。 NEB公司去年剛推出的新產(chǎn)品Q5超保真DNA聚合酶，融合了Sso7d DNA結(jié)合域。該產(chǎn)品將延伸時(shí)間縮短到了10秒/ kb，而且其保真度比Taq酶高100倍。此外，Bio-Rad公司的高保真PCR試劑也采用了DNA結(jié)合蛋白Sso7d。他們將其與有校讀活性的聚合酶融合，這種iProof DNA聚合酶能夠?qū)щy的長(zhǎng)目標(biāo)實(shí)現(xiàn)快速擴(kuò)增，還能耐受一些樣本中的PCR抑制劑。 在如今多樣化的PCR應(yīng)用中，早已無(wú)法一“酶”走遍天下。Kapa Biosystems公司開(kāi)始采用高通量的定向方法，來(lái)為特殊PCR應(yīng)用設(shè)計(jì)專門的DNA聚合酶，例如NGS�！拔覀�?cè)诖罅刻厥獾鞍字羞M(jìn)行篩選，尋找能大大增強(qiáng)酶功能的突變體，”Kapa Biosystems的技術(shù)指導(dǎo)John Foskett說(shuō)，他專門為NGS文庫(kù)擴(kuò)增設(shè)計(jì)了高保真的KAPA HiFi DNA聚合酶�！斑@一產(chǎn)品幾經(jīng)優(yōu)化，能夠有效降低PCR帶來(lái)的偏好并且提高產(chǎn)量，從而得到更為一致的測(cè)序覆蓋度，增加文庫(kù)的復(fù)雜程度�！� 百里挑一在PCR誕生初期，可供選擇的聚合酶非常有限。不過(guò)時(shí)至今日，在進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)之前，五花八門的酶就足以閃花我們的雙眼。沒(méi)的選讓人無(wú)奈，選擇太多又令人頭疼，這該如何是好？ 大多數(shù)專家在選擇PCR試劑時(shí)，主要考慮的是自己的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用和樣品的內(nèi)在性質(zhì)。如果關(guān)鍵在于擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序精確性，那么就應(yīng)選擇高保真酶。同樣，也有相應(yīng)產(chǎn)品適用于擴(kuò)增特別長(zhǎng)的DNA目標(biāo)�！癉NA重復(fù)序列會(huì)給PCR擴(kuò)增帶來(lái)難度，例如TA重復(fù)。復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)給擴(kuò)增帶來(lái)麻煩，例如復(fù)含GC的重復(fù)序列，”Majid說(shuō)。“這時(shí)你就需要性能強(qiáng)勁的酶和適宜的緩沖條件，來(lái)克服挑戰(zhàn)性的模板�！痹谶@種情況下，NEB的Q5超保真DNA聚合酶和EMD-Millipore的KOD Xtreme™ DNA聚合酶都是不錯(cuò)的選擇。 如果需要特別防范意外突變，那么最好使用帶有校讀能力的酶。若是想要得到高產(chǎn)量的DNA用于芯片檢測(cè)或NGS，就需要持續(xù)合成能力強(qiáng)延伸速度快的酶，例如EMD Millipore家的高保真KOD DNA聚合酶，或者Thermo家的Phusion高保真DNA聚合酶。此外，熱啟動(dòng)的DNA聚合酶能夠顯著提升PCR反應(yīng)的特異性，并且適用于自動(dòng)化系統(tǒng)。 常規(guī)DNA聚合酶和高保真DNA聚合酶該如何取舍，往往令人感到困惑。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于那些只需快速核對(duì)序列的常規(guī)PCR，或者對(duì)某個(gè)克隆步驟的鑒定，是不需要高保真酶的，缺乏3-5'外切酶活性的常規(guī)酶就足夠了。不過(guò)，特異性和敏感度較高的酶更有利于對(duì)低量DNA進(jìn)行擴(kuò)增。 市面上DNA聚合酶種類繁多，看得久了難免無(wú)所適從。Kapa Biosystem公司的John Foskett一針見(jiàn)血地指出，我們實(shí)際上面臨的選擇只有兩種�！氨M管市面上的PCR試劑琳瑯滿目，不過(guò)從根本上來(lái)說(shuō)就是兩類：tag或校讀型酶，tag及校讀型酶，”他說(shuō)�！癙CR試劑間任何性能上的差異，主要是來(lái)自于緩沖液或酶濃度的改變，在蛋白質(zhì)水平上并沒(méi)有根本性的差異�！� PCR之變數(shù)字PCR是本領(lǐng)域最激動(dòng)人心的創(chuàng)新之一，這一技術(shù)能夠?qū)悠分械腄NA分子數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量。目前可以進(jìn)行數(shù)字PCR的平臺(tái)包括：Life Technologies公司的QuantStudio™ 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)，Bio-Rad公司的QX100微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）系統(tǒng)，F(xiàn)luidigm公司的qdPCR 37K™ IFC系統(tǒng)，以及RainDance Technologies的RainDrop數(shù)字PCR系統(tǒng)。絕大多數(shù)數(shù)字PCR系統(tǒng)的工作原理是，將DNA樣品分成大量微小液滴，每個(gè)液滴中只含有不超過(guò)一個(gè)DNA分子，然后再進(jìn)行計(jì)數(shù)。據(jù)Bio-Rad公司的ddPCR商品化市場(chǎng)經(jīng)理James Lee介紹，“數(shù)字PCR大大提高了靈敏度和精確性，因此ddPCR特別適用于絕對(duì)定量、檢測(cè)拷貝數(shù)變異和罕見(jiàn)事件。”Life Technologies的基因分析高級(jí)市場(chǎng)開(kāi)發(fā)經(jīng)理Angelique Habis稱，數(shù)字PCR具有廣闊的應(yīng)用前景，例如檢測(cè)癌癥樣本中的罕見(jiàn)靶標(biāo)，檢測(cè)病原體，病毒載量的絕對(duì)定量，NGS文庫(kù)的質(zhì)控等等。 直接PCR是PCR領(lǐng)域的又一大創(chuàng)新，該技術(shù)無(wú)需通常的DNA純化步驟，可以直接在收集到的樣品上進(jìn)行PCR（如組織和血液）。這要?dú)w功于化學(xué)領(lǐng)域的突破，“為了能夠在這樣的條件下進(jìn)行擴(kuò)增，聚合酶必須對(duì)樣品中的PCR抑制劑有相當(dāng)強(qiáng)的抵抗力，這樣的抑制劑包括血液成分等，”Smergeliene說(shuō)�！俺掷m(xù)合成能力強(qiáng)的DNA聚合酶（如Phusion或Phire酶）就具有這樣的額外特性，這也是Thermo Scientific直接PCR試劑盒的核心。”此外，EMD Millipore的KOD Xtreme聚合酶也是為檢測(cè)原始樣品而設(shè)計(jì)的。 PCR儀之變：隨著技術(shù)的進(jìn)步，人們也在不斷改進(jìn)PCR儀的性能。例如，減少PCR所需的樣品體積，以便節(jié)省寶貴的罕見(jiàn)材料，降低試劑成本，并且減少?gòu)U棄物對(duì)環(huán)境的影響。此外，PCR儀的設(shè)計(jì)重點(diǎn)還在于提高反應(yīng)效率，同時(shí)節(jié)省實(shí)驗(yàn)室空間。舉例來(lái)說(shuō)，Thermo Scientific公司Piko PCR儀的反應(yīng)體積可以低至5 μL，該公司還提供超薄的微孔板和小管以便達(dá)到更好的熱傳遞效果，降低能源的消耗�！霸搩x器小巧輕便而且噪音低，能幫助用戶大大節(jié)省時(shí)間、試劑、空間和能源，”Thermo Fisher Scientific的產(chǎn)品經(jīng)理Kari Kataja說(shuō)。有的PCR儀廠家繼續(xù)在提高PCR的精確度和可重復(fù)性上下功夫，例如Eppendorf。“我們的熱模塊溫度精確性高，均一性好，而且能減少樣品的蒸發(fā)，”Eppendorf產(chǎn)品經(jīng)理Kay Koerner說(shuō)。 三十年前的人們一定無(wú)法想象PCR技術(shù)今天的模樣，而三十年后的今天PCR技術(shù)仍在不斷的發(fā)展�！叭昵埃瑳](méi)人料到DNA復(fù)制這樣一個(gè)簡(jiǎn)單的概念，會(huì)對(duì)生物學(xué)和人類健康帶來(lái)如此大的轉(zhuǎn)變，”Foskett說(shuō)�！艾F(xiàn)在，高靈敏度低偏好性的全基因組擴(kuò)增方法，使單細(xì)胞基因組分析得以實(shí)現(xiàn)，而這將大大推動(dòng)胚胎植入前遺傳學(xué)篩查等領(lǐng)域的發(fā)展。”人們常說(shuō)“三十而立”，PCR也在其三十歲生日之際進(jìn)入了全盛期，開(kāi)始向人們展示它的真正力量。 |
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 畜牧獸醫(yī) | PCR技術(shù) |
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biopanda
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很好的科普文章~ 
2樓2013-04-09 10:25:05
q307078056
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3樓2014-01-27 00:54:07
sy520911
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6樓2015-12-30 21:56:00
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7樓2016-04-07 08:51:25
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