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pdiudiu0214鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于雙向樣品預(yù)處理還原和烷基化的問題！請(qǐng)大俠指點(diǎn)！謝謝！
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| 各位大俠在做雙向的時(shí)候樣品預(yù)處理有還原和烷基化嗎？如果用DTT和IAA的話用量是多少？如果跑17cm的膠第二項(xiàng)恒流的電流分別是多大？時(shí)間分別是多久？鹽橋怎么搭？我們的水化和聚焦是連在一起的，是加完樣把濾紙放鉑絲上嗎？謝謝各位大俠！ |
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guxinhan123
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| 樣品預(yù)處理不用做處理，水化液里有DTT，一向聚焦結(jié)束后兩次平衡分別用ＤＴＴ和ＩＡＡ，ＤＴＴ濃度為１０ｍｌ平衡buffer0.1g，IAA１０ｍｌ平衡buffer0.25g,第二向我一般恒功率，1w/gel 過夜，早上起來加大功率，具體看遷移速度，關(guān)系不大。 |
3樓2013-04-15 18:55:20
凌波麗
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| "各位大俠在做雙向的時(shí)候樣品預(yù)處理有還原和烷基化嗎？"還原二硫鍵倒是一般必須，烷基化一般不必用。如果用DTT話用量是10-100mmol/L.第二像SDS-PAGE接通電源后一般以100V，20mA，預(yù)電泳10-20min。正式電泳時(shí)間是樣品遷移速度而定。 |
2樓2013-04-15 15:17:13
pdiudiu0214
鐵蟲 (小有名氣)
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4樓2013-04-16 10:46:00
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pdiudiu0214: 金幣+3 2013-04-16 15:47:48
pdiudiu0214: 金幣+3 2013-04-16 15:47:48
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低電流的時(shí)候是只要看到溴酚藍(lán)的線已經(jīng)移動(dòng)到膠條下方就可以升壓了，還是需要再等一段時(shí)間再升壓？這沒有似乎硬性要求，稍等會(huì)可能效果好些。 至于第二向的SDS-PAGE正式電泳時(shí)的具體電壓于凝膠類型有關(guān)，10%T的凝膠20mA-40mA均可；12.5%T的凝膠20mA，40mA，50mA均可；9-18%T的凝膠20mA-50mA均可，較高電流用于蛋白質(zhì)樣品完全走出IPG膠條（溴酚藍(lán)的線完全走出IPG膠條）,并且移走IPG后的電泳。溴酚藍(lán)的線進(jìn)入陽(yáng)極緩沖溶液約10分鐘即可終止電泳。 |
5樓2013-04-16 11:08:52
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