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shining-rose金蟲 (小有名氣)
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[交流]
總RNA的提取
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看完記得評價一下哦，呵呵，謝謝 完整RNA的提取和純化,是進(jìn)行RNA方面的研究工作,如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。所有ＲＮＡ的提取過程中都有五個關(guān)鍵點，即１）：樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；２），有效地使核蛋白復(fù)合體變性；３），對內(nèi)源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；5），對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑，1),提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；2),直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相。第一種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。 方法一:總RNA的試劑盒快速提取 一些公司推出的總RNA提取試劑盒,可以用來制備高質(zhì)量的可用于建庫的RNA。該總RNA純化系統(tǒng)采用兩種著名的RNA酶抑制劑,異硫氰酸弧(GTC)和β-巰基乙醇,加上整個操作都在冰浴下進(jìn)行,這樣就能顯著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用,將促使核蛋白復(fù)合體的解離,使RNA與蛋白質(zhì)分離,并將RNA釋放到溶液中。而進(jìn)一步從復(fù)合體中純化RNA,則根據(jù)Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法進(jìn)行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚將使RNA進(jìn)入水相,這樣使其與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離。水相中的RNA可用異丙醇沉淀濃縮。進(jìn)一步將上述RNA沉淀復(fù)溶于GTC溶液中，接著用異丙醇進(jìn)行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽，而RNA中如含無機(jī)鹽,則有可能對以后操作中的一些酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制。 一：儀器 恒溫水浴,冷凍高速離心機(jī),紫外分光光度計,取液器,電泳儀,電泳槽 二：試劑 RNA提取試劑盒,0.05%焦碳酸二乙酯(DEPC),75%乙醇 操作步驟 (一):細(xì)胞或組織破碎 A:微生物材料 １：發(fā)酵３－４天(或?qū)?shù)生長期)的菌體，離心收集菌絲體(動植物材料無需此步處理) ２：用經(jīng)DEPC處理的水洗菌絲體２－３次，并盡量除去殘存的水 ３：加液氮充分研磨，使其成為粉末，以釋放RNA ４：研磨后的樣品轉(zhuǎn)移至１２ml變性液的容器中勻漿。 B:動植物細(xì)胞培養(yǎng)材料(適用的樣品量為細(xì)胞:108) 1:細(xì)胞或組織培養(yǎng):按常規(guī)方法進(jìn)行 2:深層懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的破碎: (1)細(xì)胞收集:含一定濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液置于無菌離心管中,4℃,3000g離心5分鐘 (2)細(xì)胞洗滌:上步沉淀用25毫升滅菌后冰凍的1×PBS緩沖液洗滌,然后4℃,3000g離心5分鐘, (3)細(xì)胞破碎:在沉淀細(xì)胞中加入15毫升預(yù)冷的變性液,用無菌處理過的勻漿器勻漿 3:表面培養(yǎng)細(xì)胞的破碎: (1)確定培養(yǎng)瓶數(shù)量,使選定的各培養(yǎng)瓶細(xì)胞累加后總量達(dá)108 (2)細(xì)胞收集:將培養(yǎng)液倒掉,用預(yù)冷的無菌PBS緩沖液洗滌一次,在培養(yǎng)瓶中加入8毫升預(yù)冷變性液,轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞溶解,此時可見粘度加大. (3)用無菌吸管將第一個培養(yǎng)瓶中的液體吸入第二個培養(yǎng)瓶,旋轉(zhuǎn),溶解細(xì)胞,再吸入第三個培養(yǎng)瓶,以此類推,直到將所選定的培養(yǎng)瓶全部洗滌一次,然后從第一個培養(yǎng)瓶開始再加入4毫升上述變性液,將所有培養(yǎng)瓶洗一次. (4)將上述12毫升含細(xì)胞的變性液轉(zhuǎn)移至一50毫升無菌離心管中,勻漿破碎細(xì)胞. C:植物組織破碎(適用的樣品量為0.05g組織) (1)將600ul變性液置于1.5ml離心管中,將此離心管放于冰浴中5分鐘. (2)將0.05g新鮮組織用液氮冰凍 (3)在液氮下,研磨組織塊 (4)待液氮揮發(fā)后,將上述分散的組織轉(zhuǎn)移至無菌離心管中. D:動物組織破碎(適用的樣品量為1克組織) (1)將12毫升變性液置于50毫升離心管中,將此離心管放于冰浴中5分鐘. (2)在上述管中加入1克新鮮或冰凍動物組織,勻漿粉碎. 注1:研磨組織塊用于RNA提取的樣品,必須是新鮮的細(xì)胞或組織,如采樣后,不能立即用于提取則樣品應(yīng)用液氮速凍并貯于-70℃的冰箱中保存。 2:變性液及相應(yīng)的離心管需預(yù)冷 (二):RNA的抽提 在經(jīng)變性液勻漿的細(xì)胞或組織600ul＋60ulpH4.0的2M乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器 600ul酚\氯仿\異戊醇(25\24\1),徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒 冰裕中10-15分鐘, 離心,4℃，10000g,20分鐘 上層水相吸至無菌離心管中+等體積的異丙醇,-70℃,30分鐘沉淀RNA 離心4℃，10000g,20分鐘 沉淀RNA,冷凍干燥15分鐘 , RNA沉淀重新溶于300ul變性液中,可振蕩(有時為了幫助溶解，可在65℃加熱，但時間應(yīng)極短) 60ulpH4.0的2M乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器 600ul酚\氯仿\異戊醇(25\24\1),徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒 冰裕中10-15分鐘, 離心,4℃，10000g,20分鐘 上層水相吸至無菌離心管中 等體積異丙醇二次沉淀(-70℃,30分鐘),７５％乙醇洗沉淀,沉淀冷凍干燥,復(fù)溶于去RNA酶的水中(對于準(zhǔn)備長期保存的RNA可加入pH 5.0的乙酸鈉至終濃度為0.25M，再加入2.5體積的乙醇，－７０℃保存。) 注：1變性液組成：25g異硫氰酸胍溶于33mlCSB(42mM pH4.0乙酸鈉、0.83%十二烷基肌氨酸鈉、0.2mMβ-巰基乙醇)，65℃溶解，過濾滅菌，4℃預(yù)冷。 2酸性酚配制：55℃時，500g酚溶入500ml50mM,pH4.0乙酸鈉，混勻，靜止分層后，去上清，再反復(fù)加500ml50mM,pH4.0乙酸鈉,直到pH<4.1。 方法二:氯化鋰法提取總RNA 本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片斷丟失的缺陷。 儀器：同上 試劑： 氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，過濾滅菌】 懸浮液【10mM Tris-HCL (pH7.6) ,1mM EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】 其余同上 操作步驟： 1：對于大量組織或細(xì)胞，則每克組織或細(xì)胞加入5－10ml氯化鋰－尿素溶液，勻槳器高速勻槳2分鐘；對于少量細(xì)胞（107個細(xì)胞/ml），則每克組織或細(xì)胞加入0.5ml氯化鋰－尿素溶液手工勻槳，并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中 2：勻槳液在0－4℃放置4小時后，12000g離心30分鐘 3：取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液，重復(fù)步驟2 4：沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液復(fù)溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15－30分鐘并不時搖動混勻，4000g離心5分鐘 5：取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時，5000g離心。 6：70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。 7：RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于－70℃保存。 方法三：蛋白酶－熱酚法 本方法適合于病毒RNA的提取 儀器：同上 試劑：蛋白酶K（終濃度50ug/ml） 2×緩沖液：1%SDS 20mMTris-HCL (pH 7.6) 0.2MnaCL 其余同上 操作： 1，提純病毒液中加入等體積緩沖液、蛋白酶K,37℃40-50分鐘 2，加入等體積65℃預(yù)熱的酚溶液，輕徭,在65℃保溫5分鐘后再輕徭。 3，離心，取上清，氯仿抽提一次 4，取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時，5000g離心(10000g,10min)。 5，70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。 6，RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于－70℃保存。 上面介紹了一些核酸（DNA、RNA）提取方法，在進(jìn)行具體實驗時，應(yīng)根據(jù)研究對象的性質(zhì)，提取核酸的用途而對上述方法在操作步驟和試劑使用量上作一定的修改。以下一些原則和建議對核酸提取的操作可能會有一定的裨益。 1：在核酸提取時，為了增加細(xì)胞的裂解度，增加核蛋白復(fù)合體破碎度，以釋放更多的游離核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在確保沒有核酸水解酶存在的前提下，酶反應(yīng)時間越長越好。 2：有時在使用蛋白酶時，為了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶緩沖液中用終濃度5mM的EDTA代替NaCL，并且可將反應(yīng)溫度提高到50－60℃，并將反應(yīng)時間縮短到15－25min，但酶用量必須提高10－20倍。溶菌酶使用時緩沖液中需加EDTA，因游離金屬離子對酶有抑制。 3：許多植物材料中富含酚，在細(xì)胞破碎時，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的錕類物資，影響核酸的提取及降低提取質(zhì)量，在提取液中加入PVP和巰基乙醇對降低酚類的干撓可能有所幫助。PVP將與酚形成復(fù)雜的聚合體，在提取時將酚從核酸成分中游離。且PVP與巰基乙醇作為強(qiáng)還原劑可防止多酚的褐變。另外作為還原劑的這些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。 4：許多生物材料在提取核酸時，都會遇到多糖的污染問題，具體表現(xiàn)為有機(jī)溶劑沉淀時，沉淀很多，但復(fù)溶時，大量沉淀不溶，電泳觀察時核酸含量很低。克服多糖污染可采用以下一些辦法 （1）CTAB多次抽提。 （2）在有機(jī)溶劑沉淀時先稀釋樣品濃度（可到10倍左右），對低濃度樣品再進(jìn)行沉淀。 （3）在有機(jī)溶劑沉淀時選用異丙醇和5MNaCL作為沉淀溶劑，此時氯化鈉的用量可用到1/5-1/2的體積，異丙醇可用到0.6-1的體積。異丙醇沉淀核酸時，高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中，從而可達(dá)到去多糖的作用。但高濃度的鹽存在會影響核酸的進(jìn)一步操作，因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。 5：在核酸提取時，酚與氯仿均起到變性的作用。酚的變性能力強(qiáng)于氯仿，但酚與水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能損失部分核酸外，水相中還會殘留酚，而酚的存在將對核酸的酶反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)的抑制，因此在操作中可單用氯仿作變性劑、也可用酚/氯仿混合變性，也可用單一酚作變性己，但用單一酚后在有機(jī)溶劑沉淀時一定要用氯仿從抽提。 6：在操作中當(dāng)加入變性劑氯仿后，為了保證核酸樣品的完整性，操作要輕，尤其在提DNA時，更要避免劇烈操作。 7：在沉淀核酸時可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強(qiáng)于異丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高時，用異丙醇沉淀可部分克服這種污染，尤其用異丙醇在室溫下沉淀對擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。 8：在提取核酸時，如樣品濃度低，則應(yīng)增加有機(jī)溶劑沉淀時間，－70℃下>30min;－20℃過夜將有助于增加核酸的沉淀量。 9：在核酸提取過程中有機(jī)溶劑沉淀后復(fù)溶時可加水因此時離子濃度可能較高，而到高度純化后低溫保存時最好復(fù)溶于TE緩沖液中，因溶于TE的核酸儲藏穩(wěn)定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸樣品保存時要求以高濃度保存，低濃度的核酸樣品要比高濃度的更易降解。 10：核酸提取后可通過PCR 、RT－PCR直接擴(kuò)增出目的基因片斷，也可首先構(gòu)建文庫、然后由RACE、dd-PCR等差異顯示技術(shù)、AFLP等標(biāo)記技術(shù)、差異雜交或文庫扣除技術(shù)等方法篩選出特異探針，再用此探針從文庫中篩選出完整基因。有關(guān)這些內(nèi)容在下面各篇幅中會詳細(xì)介紹。 [ Last edited by shining-rose on 2007-9-19 at 21:35 ] |
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