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xurong1127新蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR問題
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各位大俠,誰能幫幫我啊!我構(gòu)建MMP7質(zhì)粒,克隆全長(zhǎng).上游引物:MMP7-F: 5’ CGGGATCCATC AAC CAT AGG TCC AAG AAC 3’ 酶: BamHI MMP7-R: 5’CGGAATTCTTT CTT TCT TGA ATT ACT TCT C 3’ 酶: ECOR I 普通PCR根本做不出,模板換了好幾種,用Touchdown可以做出淡淡的調(diào)帶 我的反應(yīng)條件是:95℃ 3分鐘 ,95℃ 45s 60-50℃逐漸降溫 30s ,72℃ 1分鐘,然后50℃ 30個(gè)循環(huán), 72℃ 10分鐘 ,誰能幫我想想還有別的好辦法嗎? 我的引物也換過一次,之前的引物也是各種方法都試了!就是做出不去 我的反應(yīng)體系 25微升 水 16.85 ,dNTP 4, 10xbf 2.5, 引物 1 0.2, 引物2 0.2 ,Taq酶 0.25 CDNA 1 , [ Last edited by xurong1127 on 2013-4-18 at 16:40 ] |
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amisking: 金幣+3, MolEPI+1, 鼓勵(lì)積極發(fā)帖幫助解答問題。 2013-04-18 20:12:07
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問題都問不清楚 1.你的模板是什么��？ “模板換了好幾種”這也叫線索��？ 2.你的目的是什么��？ “我構(gòu)建MMP7質(zhì)粒,克隆全長(zhǎng)”，這也叫目的啊，MMP7是什么啊，克隆全長(zhǎng)？那你直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，提質(zhì)粒，做個(gè)single digest不就是全長(zhǎng)了。 3.實(shí)驗(yàn)情況是什么啊？ “淡淡的條帶”，你以為淡淡的憂傷啊。有條帶你丫難道還P不出來了？（是條帶，不是調(diào)） 4.你要P的目的條帶全長(zhǎng)基因多少��？ “95℃ 3分鐘 ,95℃ 45s 60-50℃逐漸降溫 30s ,72℃ 1分鐘,然后50℃ 30個(gè)循環(huán), 72℃ 10分鐘 ”你確定45s，30s，1min分分鐘能搞出下一代嗎 5.反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，引物你加0.2ul？你看是不是太摳了點(diǎn) |
3樓2013-04-18 18:14:45
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10樓2013-04-20 09:16:23
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14樓2013-04-22 16:29:52
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17樓2013-04-24 10:03:52
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1.我用的模板有:膠質(zhì)瘤 H4細(xì)胞,肺小細(xì)胞癌H1299, 胃癌 AGS,腸癌 HT-29, 腎癌 293T,還有文庫買的腦組織的,還有一個(gè)不知道是什么也是文庫買的,我看了別人的文獻(xiàn),按道理這些癌里面都有這基因表達(dá)的,我們實(shí)驗(yàn)室都用這幾種模板的. 2. 問題是我們沒有MMP7質(zhì)粒 3.MMP7基因全長(zhǎng)780左右 4.引物加0.2差不多了吧!我克隆過CD24,才加0.1,也出來了哦!發(fā)現(xiàn)這基因太不好了,上面G多,下面T多, 怎么設(shè)計(jì)引物都有錯(cuò)配的出現(xiàn). 還有我以前的引物是 MMP7: MMP7-F: 5’ GGGGTACCGCGA CTC ACC GTG CTG TGT GCT GT 3’ 酶: Kpn1 MMP7-R: CGGAATTC CTA TTT CTT TCT TGA ATT ACT TCTCT 3’ 酶: ECOR I 請(qǐng)問您有什么好辦法嗎? |
6樓2013-04-19 09:16:10
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