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danielyoung銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
我最近用SSR去擴(kuò)增BAC文庫怎么都沒有目的擴(kuò)增片段，求原因？
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| 最近用實(shí)驗(yàn)室的SSR引物去擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的BAC文庫，可是沒有目的條帶的出現(xiàn)，過年以前擴(kuò)增的結(jié)果比較好，但是到了年后就不好了，求大家給予幫助，找出原因，謝謝！ |
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凌波麗
專家顧問 (知名作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 真是大牛，膜拜ing 2013-04-21 18:23:22
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 真是大牛，膜拜ing 2013-04-21 18:23:22
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原因可能有很多，最重要一個(gè)就是PCR擴(kuò)增的問題。 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有（1）模板核酸的制備，（2）引物的質(zhì)量與特異性，（3）酶的質(zhì)量，（4）PCR循環(huán)條件和反應(yīng)體積的改變。（5）鎂離子的濃度尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。 模板：a.模板中含有雜蛋白質(zhì)，b模板中含有Taq酶抑制劑，c模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，d在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚,e模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。 Taq酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠�！ � Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。一般Mg2+離子濃度可以從1mmmol/L逐漸上升，到10mmmol/L就不要再高了，每次上升Mg2+離子濃度的梯度為1mmmol/L�！ � PCR循環(huán)條件和反應(yīng)體積的改變：PCR循環(huán)25次也就差不多了，再往后可能擴(kuò)增的專一性就不一定能保證了，高手除外。通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul�；�100ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。 引物：既然你過去都能成功，估計(jì)引物序列問題不大，但是要調(diào)整引物濃度和其與模板的結(jié)合溫度。 總體上，最先檢查模板質(zhì)量和酶質(zhì)量，再調(diào)Mg2+濃度，接著調(diào)引物濃度和其與模板的結(jié)合溫度，再控制循環(huán)次數(shù)和反應(yīng)體積，這些都不行，那就要重新設(shè)計(jì)引物。 |
2樓2013-04-21 12:05:39
danielyoung
銀蟲 (初入文壇)
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3樓2013-04-21 14:11:25
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