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[求助]
免疫組化酶標(biāo)出現(xiàn)的問(wèn)題求分析
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因?yàn)槲矣玫氖侵安±砜茮](méi)有做過(guò)的抗體SFRP1，所以尚在摸索條件階段，幾次預(yù)實(shí)驗(yàn)做下來(lái)，效果都不好，故求助，希望得到又經(jīng)驗(yàn)的蟲(chóng)友們指導(dǎo)。 總的來(lái)說(shuō)，要么非特異性染色（背景染色）很強(qiáng)，滴加DAB后幾秒鐘就出現(xiàn)棕黃色改變，彌漫性的。要么就全部陰性結(jié)果，或弱陽(yáng)性，無(wú)法區(qū)分是否是實(shí)驗(yàn)操作的問(wèn)題，還是抗原本身的有無(wú)。有時(shí)候又蘇木素核染色很強(qiáng)，組織彌漫性藍(lán)色深染。 求指導(dǎo)的幾個(gè)要點(diǎn)是： 1，抗原修復(fù)液的配制。第一次因?yàn)楸尘叭旧珡?qiáng)，第二次調(diào)整了抗原修復(fù)液的PH（用的tris-EDTA，由pH8.0降至pH6.5)。用的是微波修復(fù)，解凍檔。2*5min。我用的是3mM Tris+ 0.4mM EDTA 然后用濃鹽酸調(diào)pH. 2.TBS的配制。我用的是20gTris 溶解于1000ml蒸餾水，加濃鹽酸調(diào)pH到7.5左右。濃度大概是0.165mol/L。 3.蘇木素染色5-6min，然后涼水沖洗，然后1%鹽酸酒精分化（2秒）,然后熱水沖洗反藍(lán)。但是有的片子效果會(huì)是藍(lán)色很深。有的片子核就染的很輕。求指導(dǎo)！ 4，脫蠟時(shí)間是否越長(zhǎng)越好？因?yàn)橛玫氖枪玫亩妆�，所以是在里面室�?0-50分鐘，怎樣看是否脫蠟干凈？ 5，在開(kāi)始和結(jié)束的時(shí)候都用到梯度酒精，是每個(gè)濃度的放置1分鐘，還是蘸一下就拿出來(lái)？ 6，關(guān)于洗TBS，是放置在其中浸泡3-5分鐘，還是涮幾下？ 7，關(guān)于抗體稀釋液，是用1%牛血清溶液稀釋好，還是TBS稀釋好？如果用1%小牛血清溶液稀釋，是否還需要用5%牛血清封閉液封閉？ 8，稀釋后的DAB最多能夠在4度冰箱里放置多久？過(guò)夜的是否可以使用? 因?yàn)橛昧朔帕?天的稀釋后避光4度保存的DAB，全部是陰性結(jié)果，無(wú)法判斷是DAB失效，還是抗原陰性。 9，因?yàn)椴豢赡苊空{(diào)整一個(gè)步驟都做陽(yáng)性陰性對(duì)照，因?yàn)殛?yáng)性組織不好找，所以只能是通過(guò)調(diào)整試驗(yàn)步驟達(dá)到基本符合預(yù)期的效果。但是操作又實(shí)在是沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)，所以不懂怎么分析和調(diào)整。 效果做出來(lái)實(shí)在是差別千萬(wàn)里，每個(gè)步驟更改過(guò)后得到的結(jié)果又總是不特別理想。因?yàn)槭切率郑總�(gè)環(huán)節(jié)都可能存在錯(cuò)誤，貼在這里，希望得到有經(jīng)驗(yàn)人士的指導(dǎo)。非常感謝！ |
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
amisking: 金幣+1, 鼓勵(lì)積極發(fā)帖幫助解答問(wèn)題。 2013-04-25 22:05:49
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