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H-xiangzhu金蟲 (正式寫手)
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[求助]
引物設(shè)計
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| 基于primer premier 5.0 進(jìn)行引物設(shè)計，但是出來后發(fā)現(xiàn)序列太短，不知道是不是保守序列選擇不當(dāng)，請問蟲友怎么選定的保守序列？用什么方法設(shè)計出來的序列可以長點呢?期待蟲蟲的回復(fù)，謝謝~~ |
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dafeizizhu
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
H-xiangzhu(gyesang代發(fā)): 金幣+2, 熱心的蟲子，詳盡的解答！ 2013-05-02 12:15:23
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H-xiangzhu(gyesang代發(fā)): 金幣+2, 熱心的蟲子，詳盡的解答！ 2013-05-02 12:15:23
| 我不知道你要擴(kuò)增什么，是RACE PCR還是其他的什么。我這里給你兩個實例，你看看對你有沒有幫助。第一，我的一個同學(xué)做的mtDNA擴(kuò)增的，她的情況是知道要擴(kuò)增片段兩端的序列，中間的序列是目的片段，但是大小與序列都是不可知的，這時設(shè)計引物，就在兩端設(shè)計，至于能擴(kuò)增出多少bp的片段，不可知。多少bp都是有用的。第二，我的另一個同學(xué)，他是做RACE的，保守區(qū)設(shè)計引物需要簡并引物，這時需要很多對，至于大小，就根據(jù)你使用Primer 5了，想要多少就能多少。所以，你能告訴我你做什么的，大致啊，我就可以幫幫你，盡我所能吧。 |
2樓2013-05-02 10:11:09
H-xiangzhu
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3樓2013-05-02 21:11:13
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【答案】應(yīng)助回帖
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H-xiangzhu(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖應(yīng)助！ 2013-05-04 19:34:27
H-xiangzhu(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖應(yīng)助！ 2013-05-04 19:34:27
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primer 5 是可以手動收索引物對的，可以先固定一端，然后再找另一端。找到之后可以看看評分，什么二聚體，發(fā)夾結(jié)構(gòu)，錯配等。如果這樣設(shè)計引物，有一點是不太好的，就是可能找不到最理想的引物對，可能下面的幾個按鈕總有一個或幾個是紅色的。這時，就得看看什么條件最影響實驗，個人建議以錯配最少為好。適量允許發(fā)夾結(jié)構(gòu)和二聚體的存在，因為這兩個方面的問題可以通過提高退火溫度來解決。你的情況和我同學(xué)擴(kuò)增mtDNA上D-loop一樣的。還有，要找一對引物適合多種物種，建議你先比對這些物種保守區(qū)有沒有共同序列，雖說是保守區(qū)，但也或多或少有些區(qū)別的。要找到共同序列就好說了。 |
4樓2013-05-04 08:11:24
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