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小木蟲論壇-學術(shù)科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 包涵體復性
| 查看: 1553 | 回復: 23 | ||
[求助]
包涵體復性
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最近做兩個蛋白，復性的時候遇到問題，換了好幾個復性條件，結(jié)果總是在2MU的時候完全沉淀。上次做出來了用的復性Buffer為20mMTris，0.015%SDS，1mMEDTA和分別的2MU、1MU、0MU 首先是進行稀釋1倍（用槍逐滴加入），然后分別依次透析 今天重復做，不知道為什么總是在稀釋復性的時候就沉淀了，為什么 請大家指教 |
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10樓2013-05-24 14:59:39
2樓2013-05-23 14:32:12
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
475502411: 金幣+10, ★★★很有幫助 2013-05-24 09:19:52
myprayer: 金幣+2, 贈人玫瑰手有余香，感謝你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-03 13:45:59
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并不是所有的蛋白都可以稀釋復性。 有一些蛋白分子無法越過中間態(tài)而轉(zhuǎn)向于聚集沉淀，這是正常的。通常透析時濃度在0.1一下，可以加入0.5M arg抑制分子聚集，進而使復性向正確折疊的方向移動。 你的蛋白天然狀態(tài)有沒有二硫鍵呢？這個你要確定，因為有二硫鍵的話你要用氧化還原體系來形成正確的鏈內(nèi)二硫鍵。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
4755024113樓2013-05-24 08:21:00
4樓2013-05-24 09:19:33
生物小通
木蟲 (正式寫手)
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- 專業(yè): 腫瘤復發(fā)與轉(zhuǎn)移
5樓2013-05-24 09:42:52
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
475502411: 金幣+8, ★★★很有幫助 2013-05-30 11:51:27
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475502411: 金幣+8, ★★★很有幫助 2013-05-30 11:51:27
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰手有余香，感謝你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-03 13:47:59
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有七個二硫鍵，在之前透析的時候如果沒有還原性-sh存在，你的蛋白很容易聚集沉淀。 建議：在>2m尿素之前的透析中加入2mm dtt防止聚集形成多聚體。而你破碎溶解包涵體的時候更要加。 在2m尿素的時候，蛋白濃度調(diào)到0.2mg/ml左右，透析到含有10mm GSh,1mm gssg（也叫g(shù)ssh）中，4度過夜。然后再透析到更低濃度的尿素中。謝謝。 |
6樓2013-05-24 10:00:16
7樓2013-05-24 11:16:57
8樓2013-05-24 11:22:59
9樓2013-05-24 14:34:38
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