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[交流]
核酸提取求助:幫忙分析下失敗原因在哪?
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我的提取程序是200ul總消化體積,1%SDS,200ug/ml,消化過(guò)夜..... 之后是標(biāo)準(zhǔn)酚氯仿抽提.... 1%瓊脂糖凝膠檢測(cè) 只有最前沿有很弱的拖帶出現(xiàn)(疑似RNA) 酚抽提后加入氯仿異戊醇(24:1)后離心后 上清很渾濁 出現(xiàn)大量絮狀沉淀(這些是什么 蛋白質(zhì)么?) , 加入氯仿異戊醇(24:1)后 好象無(wú)法混勻 始終是分層狀態(tài),這樣正常么,不是要搖成乳狀,再離心么 我重新提了一次還是這個(gè)樣子 [ Last edited by linkfuture on 2007-10-12 at 11:58 ] |
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guohuayin
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telomerase(金幣+2,VIP+0):thanks!歡迎來(lái)多多交流�。�！
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抽提核酸中我的做法是 首先加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇（體積比25：24：1），輕輕上下顛倒幾次，混勻2分鐘左右，12000rpm，離心10分鐘； 然后吸取上清液，加入等體積的氯仿：異戊醇（體積比24:1)和上面的步驟一樣，抽提一次，取上清 這兩步試驗(yàn)可以反復(fù)三次，主要是去除蛋白質(zhì)和糖類(lèi)等雜質(zhì)。 最后加入1/10體積的3M的醋酸鈉（.PH5.3），2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA。 －20度放置30分鐘，室溫15000rpm,離心10分鐘，沉淀用70％的乙醇洗滌去除鹽分，稍微干燥后，加入適量的緩沖液溶解。－20度冰箱中保存。 [ Last edited by guohuayin on 2007-10-9 at 16:33 ] |
2樓2007-10-09 16:31:15
3樓2007-10-10 12:19:10
yangguoxing888
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4樓2007-10-10 12:31:18
tsguest
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5樓2007-10-10 12:31:23
6樓2007-10-10 13:58:27
yzh-1999
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johnsooh(金幣+2,VIP+0):歡迎討論
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謝謝樓上的 回復(fù),,我的提取程序和你的差不多, 是不是我混勻時(shí)間太長(zhǎng) 太劇烈 導(dǎo)致DNA斷裂呢(我每次都要上下顛倒混勻10min) 氯仿異戊醇冷凍離心后為什么上清很渾濁呢 是SDS的遇冷的原因么 還是Pr ======================= 不對(duì)。 說(shuō)太劇烈導(dǎo)致鏈斷裂，最后使得溶液渾濁這個(gè)說(shuō)法太牽強(qiáng)。 我還是同意樓主說(shuō)的，是消化不徹底的問(wèn)題。我抽提RNA時(shí)，若樣本太多，導(dǎo)致Trizol不夠用的時(shí)候，也會(huì)出現(xiàn)大量的渾濁。我想可能是你沒(méi)有加蛋白酶K，或量太少，導(dǎo)致蛋白消化不徹底，所以后續(xù)加酚不能使它沉淀分層。 冷凍后，這些懸在溶液中的蛋白析出，很正常。 所以，從消化開(kāi)始，再注意點(diǎn)。 歡迎繼續(xù)探討！ |
7樓2007-10-10 14:56:23
8樓2007-10-12 12:03:53
insect2004
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johnsooh(金幣+1,VIP+0):thx
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| 看膠帶是沒(méi)有，這就奇怪了，按理來(lái)說(shuō)有白色沉淀應(yīng)該就是DNA，而且還溶解了，你用的EB染色是不是濃度太低，或用的時(shí)間太長(zhǎng)，把EB換成新的，另外加上MARK, 這樣如果MARK跑出來(lái)而你的DNA沒(méi)有跑出來(lái)，那就說(shuō)明不是染色的問(wèn)題，你再找別的原因，如果你不是用試劑盒提得，那你就檢查一下你的關(guān)鍵試劑有沒(méi)有問(wèn)題，原因得一步步找，實(shí)驗(yàn)做得多了，你的經(jīng)驗(yàn)也就多了，你再多提幾次，祝順利！ |
9樓2007-10-12 14:29:41
10樓2007-10-12 15:36:47
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