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759986494金蟲 (著名寫手)
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20093651
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2樓2013-05-26 23:02:18
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（1）制膠：首先需要將玻璃板洗凈，然后小心地將長(zhǎng)短兩塊玻璃板裝配到灌膠架上。分別量取15 mL 40%和65%變性劑溶液，加到兩支試管中，每管加15 µL TEMED和120 µL 10%過硫酸銨，迅速搖勻之后，用兩只注射針筒分別吸取高、低濃度的變性劑溶液，采用三通管分別連接這兩支針筒和一只注射針頭，將針頭小心地插進(jìn)玻璃板之間的縫隙中，針頭與水平面保持垂直。使用梯度膠制備裝置制備濃度梯度為40~65%的垂直膠，快速完成灌膠之后插上梳子。需要注意的是，灌膠需要盡可能保持勻速，且液體應(yīng)從針頭垂直流下。如不垂直，則有可能是玻璃板沒有洗凈所致。 （2）電泳：在等待聚丙烯酰胺膠凝固的同時(shí)加熱電泳槽中的TAE緩沖液。待聚丙烯酰胺膠凝固之后拔出梳子，將20 µL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與Loading Buffer混合后加入到梳孔中并開始電泳。打開加熱器和水泵，電壓可設(shè)置150 V，運(yùn)行時(shí)長(zhǎng)7 h。電泳時(shí)電泳槽中TAE緩沖液的溫度保持在60 oC。電泳完成后，關(guān)掉電源和系統(tǒng)（加熱器、泵和開關(guān)）。取出溫度控制儀并將它安放在Dcode防護(hù)帽架上，再將裝有玻璃板的裝置取出，小心地將玻璃板從裝置上分離，再將短玻璃板從凝膠上移走，此時(shí)凝膠平鋪在長(zhǎng)玻璃板上。 （3）染色：用DNA熒光染料涂抹聚丙烯酰胺凝膠表面，或?qū)⒛z浸泡在DNA染料中，避光條件下對(duì)DNA進(jìn)行熒光染色20 min，之后采用脫色搖床洗去凝膠表面的熒光染料。 （4）檢測(cè)和分析：將凝膠轉(zhuǎn)移至成像系統(tǒng)中，首先打開白燈確定凝膠位置，再打開紫外觀察條帶。采用凝膠分析軟件（如Quantity One）對(duì)DGGE圖譜中條帶的強(qiáng)度進(jìn)行分析。 |
3樓2013-06-19 15:17:33
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