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這算是包涵體嗎？
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這個(gè)問題是困擾我好長時(shí)間了。我構(gòu)建了一個(gè)重組菌，全細(xì)胞活性很高，但是在破碎這一步，怎么也破不出來，沉淀里目標(biāo)蛋白很多，上清很少，曾懷疑過是包涵體，但是破碎后沉淀還是有很高的活性（用200w功率破時(shí)，比上清的活性高）。 我做的嘗試： 1我試過改變破碎條件，增加功率和破碎時(shí)間。當(dāng)增加到400w時(shí)，上清活性上去了（比全細(xì)胞活性差遠(yuǎn)了），沉淀活性低了，但是蛋白電泳顯示沉淀里的蛋白還是特別多，上清少。這是怎么回事��？是包涵體嗎？ 2.懷疑是包涵體，所以試著改變誘導(dǎo)條件，降低IPTG濃度，甚至用乳糖誘導(dǎo)，降低誘導(dǎo)溫度，但是還是這樣，破碎液很白，不透明，蛋白電泳結(jié)果也是這樣。但是我用未誘導(dǎo)的重組菌做對比，發(fā)現(xiàn)破碎液透亮了。 請問，這一系列的實(shí)驗(yàn)，能說明是包涵體嗎？ |
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3樓2013-05-29 15:35:48
cicelyzh
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我覺得應(yīng)該是包涵體。未誘導(dǎo)的菌超聲能破，說明超聲程序是沒問題的。當(dāng)然，不排除誘導(dǎo)后的菌體不如為誘導(dǎo)的好破。你的上清和沉淀跑電泳，并不能說明蛋白在上清和包涵體里面的比例。因?yàn)榇嬖谝粋�(gè)破損率的問題。未破的菌體用SDS上樣緩沖液處理后會破碎。你應(yīng)該在超聲前取一定體積的菌體。用上樣BUFFER直接破碎菌體得全菌蛋白。然后用超聲后同樣體積的上清跑可溶蛋白。再比較目的蛋白在上清和全菌蛋白中的比例。 如果你已經(jīng)嘗試了改變誘導(dǎo)條件，效果都不理想，你可以試試直接純化包涵體后復(fù)性。如果能獲得活性蛋白，就不用糾結(jié)是在上清里還是沉淀里的問題了。 |
2樓2013-05-28 08:17:36
4樓2013-05-30 15:57:59
kedaxiaoyu
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5樓2013-05-30 16:28:20
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