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86967662新蟲 (初入文壇)
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小分子（9KD）Trincine 膠且戊二醛固定后的轉(zhuǎn)膜條件
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最近在做一種脂肪因子apelin，一抗購自abcam，第一次做的時候撞大運，用20％的SDS-PAGE做出來一個條帶（非常不清晰），后來增大一抗?jié)舛�，延長或者減少轉(zhuǎn)膜時間（一直為濕轉(zhuǎn)，200mA恒流），但是目的條帶再也沒出現(xiàn)過，最近改用了TRICINE膠，跑膠后戊二醛固定，轉(zhuǎn)膜條件為：濕轉(zhuǎn)，200mA，1個小時。增大上樣量為50ug/孔，低溫條件，分離膠之前30V小電壓跑，大約2-3h，溴酚藍(lán)前鋒指示劑進(jìn)入分離膠約5mm時用100V電壓，指示劑跑至距玻璃板下沿約5-10mm時停止電泳，電泳完成后用0.5%戊二醛30%乙醇混合液固定凝膠20min。轉(zhuǎn)膜條件：0.22 NC膜，冰浴，200mA，60min。麗春紅染色能在MARKER 10KD以下隱約看到條帶，發(fā)光后片子上背景很深，目的條帶隱約可見，顏色特別淡，現(xiàn)在的問題：1.轉(zhuǎn)膜時間，在電泳跑完之后用戊二醛固定20分鐘后，對于小分子 9KD，轉(zhuǎn)膜時間大概需要多長，根據(jù)考馬斯亮藍(lán)染膠時間推測，200mA，1小時10分鐘，2小時，膠上仍有小分子蛋白存在（見附件圖片），請教老師，老師說戊二醛固定后，按照目前考染的結(jié)果看，再延長一個小時也沒問題，今天延長轉(zhuǎn)膜時間至2小時30分鐘和3小時后，發(fā)光結(jié)果感覺還不如昨天1小時10分鐘跑的。我覺得還是轉(zhuǎn)膜時間問題，請前輩指教一下這種情況下小分子蛋白的轉(zhuǎn)膜時間。 第一次apelin.JPG 轉(zhuǎn)膜1小時10分鐘的片子xiu.JPG 轉(zhuǎn)膜2小時后考染膠上仍可見xiu.JPG 轉(zhuǎn)膜2個半小時后考染xiu.JPG |
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