版塊導(dǎo)航: 正在加載中...

應(yīng)《網(wǎng)絡(luò)安全法》要求，自2017年10月1日起，未進(jìn)行實(shí)名認(rèn)證將不得使用互聯(lián)網(wǎng)跟帖服務(wù)。為保障您的帳號(hào)能夠正常使用，請(qǐng)盡快對(duì)帳號(hào)進(jìn)行手機(jī)號(hào)驗(yàn)證，感謝您的理解與支持！

24小時(shí)熱門(mén)版塊排行榜

返回列表

上一頁(yè)

凌波麗

專家顧問(wèn) (知名作家)

專家經(jīng)驗(yàn): +218
MolEPI: 44
應(yīng)助: 397 (碩士)
貴賓: 0.044
金幣: 2118.9
散金: 10
紅花: 208
帖子: 5633
在線: 571.6小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 1766465
注冊(cè): 2012-04-19
性別: MM
專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
管轄: 生物科學(xué)綜合

【答案】應(yīng)助回帖

2010年時(shí)，我從網(wǎng)上摘錄的一份材料，樓主可以參考.
"原核表達(dá)個(gè)人秘笈：表達(dá)前的分析比什么都重要

http://www.freeduan.com/viewthre ... ;amp;extra=page%3D1
表達(dá)不同于其它一些實(shí)驗(yàn)，比如：提取質(zhì)粒、PCR、電鏡切片，這些人為控制的因素比較多，出問(wèn)題相對(duì)來(lái)說(shuō)也比較好分析。表達(dá)呢，你把質(zhì)粒克隆好啦，交給細(xì)胞，然后有些事情就不全是你要怎樣就怎樣了。原核表達(dá)在表達(dá)當(dāng)中來(lái)說(shuō)還是比較簡(jiǎn)單，細(xì)菌培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)速度快，需要的儀器和培養(yǎng)基都比較便宜。當(dāng)然，它也存在一些缺乏高級(jí)修飾、細(xì)胞內(nèi)部還原性過(guò)高等缺點(diǎn)。                    原核表達(dá)從一開(kāi)始的設(shè)計(jì)就非常重要，所謂好的開(kāi)始是成功的一半。做足準(zhǔn)備功夫，可是省去很多將來(lái)后悔的事情。首先，我們要根據(jù)是否要求可溶將載體分成兩大類，如果希望可以同時(shí)嘗試多種表達(dá)系統(tǒng)，也有許多商業(yè)化的系統(tǒng)供選擇。                    前面已經(jīng)介紹過(guò)許多公司的商業(yè)化載體、菌株和多系統(tǒng)表達(dá)體系，現(xiàn)在我想先從自己的蛋白分析講起。同樣的載體、同樣的系統(tǒng)，很可能表達(dá)這個(gè)蛋白表達(dá)量奇高，但是另外一個(gè)就是做不出來(lái)，所以沒(méi)有萬(wàn)能的載體，只有永恒的分析。當(dāng)然如果你的蛋白曾經(jīng)在原核系統(tǒng)中成功表達(dá)出來(lái)那是最好的，選擇同樣的載體表達(dá)成功率會(huì)高很多。如果沒(méi)有也最好嘗試找一些曾經(jīng)表達(dá)過(guò)和你的蛋白擁有相類似結(jié)構(gòu)的文獻(xiàn)。比如大部分含有哺乳動(dòng)物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列載體表達(dá)出來(lái)的。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而言，含有較少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小為60kD的單體蛋白較容易表達(dá)。          
在下面將列出幾個(gè)影響表達(dá)的因素，大家可以在表達(dá)前根據(jù)這幾個(gè)因素自己分析一下：            
  1、翻譯起始位點(diǎn)    現(xiàn)在大部分的表達(dá)載體都提供起始位點(diǎn)，所以它已經(jīng)把起始密碼子與核糖體結(jié)合位點(diǎn)的距離進(jìn)行優(yōu)化了，一般情況下不需要自己再加，不過(guò)還是要留意載體圖譜上是否注明有起始密碼子和終止密碼子
2、GC含量    表達(dá)序列中的GC含量超過(guò)70％的時(shí)候可能會(huì)降低蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)水平。GC含量可以利用DNA STAR、Vector NTI Suite等軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)。
3、二級(jí)結(jié)構(gòu)    在起始密碼子附近的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可能會(huì)抑制翻譯的起始或者造成翻譯暫停從而產(chǎn)生不完全的蛋白。如果利用軟件分析DNA或RNA結(jié)構(gòu)上有柄（stem）結(jié)構(gòu)，并且結(jié)合長(zhǎng)度超過(guò)8個(gè)堿基，這種結(jié)構(gòu)會(huì)因?yàn)槲稽c(diǎn)專一突變等因素而變得不穩(wěn)定。
4、基因或者蛋白的大小    一般說(shuō)來(lái)小于5kD或者大于100kD的蛋白都是難以表達(dá)的。蛋白越小，越容易被降解。在這種情況下可以采取串聯(lián)表達(dá)，在每個(gè)表達(dá)單位（即單體蛋白）間設(shè)計(jì)蛋白水解或者是化學(xué)斷裂位點(diǎn)。如果蛋白較小，那么加入融合標(biāo)簽GST、Trx、MBP或者其它較大的促進(jìn)融合的蛋白標(biāo)簽就較有可能使蛋白正確折疊，并以融合形式表達(dá)。                
 對(duì)于另一個(gè)極端，大于60kD的蛋白建議使用較小的標(biāo)簽，如6×組氨酸標(biāo)簽。對(duì)于結(jié)構(gòu)研究較清楚的蛋白可以采取截取表達(dá)。當(dāng)然表達(dá)時(shí)要根據(jù)目的進(jìn)行截取，如果是要進(jìn)行抗體制備而截取，那么一定要保證截取的部位抗原性較強(qiáng)。對(duì)于抗原性也可以利用軟件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在線軟件，不過(guò)在分析之余也要認(rèn)識(shí)到這是一種數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的結(jié)論，如果蛋白和免疫動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的話還是不妨一試的。5、親疏水性    這也是一種經(jīng)驗(yàn)之談，相信經(jīng)常做表達(dá)的人都發(fā)現(xiàn)表達(dá)親水區(qū)域時(shí)表達(dá)量會(huì)比較高，如果你要表達(dá)一個(gè)膜蛋白，那么勸你做好長(zhǎng)期抗戰(zhàn)的準(zhǔn)備吧。有許多軟件可以對(duì)氨基酸的親疏水性進(jìn)行分析，比如Vector NIT Suite，除此之外還可以利用在線跨膜區(qū)預(yù)測(cè)軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ 對(duì)跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)。對(duì)于自己表達(dá)的蛋白有所了解后就可以開(kāi)始對(duì)載體進(jìn)行選擇了，目前商業(yè)化的載體基本上包含以下幾個(gè)元件：    除了上面標(biāo)出的元件外還需要有復(fù)制起點(diǎn)，它對(duì)于控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)非常重要；另外就是篩選標(biāo)記了，比如藍(lán)白斑篩選的lacZ，各種抗生素標(biāo)記。在以上幾個(gè)元件中，我們需要注意的是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)與啟動(dòng)的元件，也就是調(diào)控子和啟動(dòng)子。其中啟動(dòng)子對(duì)于蛋白表達(dá)的速度起著舉足輕重的作用，它與最終蛋白的表達(dá)量、是否可融密不可分。這里，對(duì)于世面上廣泛銷售的幾種原核表達(dá)載體使用的啟動(dòng)子進(jìn)行總結(jié)。                  
啟動(dòng)子來(lái)源調(diào)控手段（濃度）強(qiáng)度                
   LacUV5 乳糖操縱元 lacI/IPTG (0.1-1mM) 強(qiáng)                 
 Trp 色氨酸操縱元 trpR 3-β-吲哚丙烯酸強(qiáng)                 
 Tac 結(jié)合了色氨酸啟動(dòng)子的-35序列和乳糖啟動(dòng)子的-10序列
lacI/IPTG (0.1-1mM) 強(qiáng)                 
 PL λ噬菌體 λcI阻遏物/溫度強(qiáng)                 
 噬菌體T5 T5噬菌體 lacI/IPTG (0.1-1mM) 強(qiáng)                   
pBAD 阿拉伯糖操縱元 AraBAD/阿拉伯糖（1μm-10mM）嚴(yán)謹(jǐn)                 
 T7 T7 RNA聚合酶 lacI/IPTG (0.1-1mM) 非常強(qiáng)                    
乳糖操縱子是應(yīng)用最廣泛的調(diào)控模式，除了IPTG這種化學(xué)誘導(dǎo)方式之外還有利用吲哚丙烯酸和阿拉伯糖的化學(xué)誘導(dǎo)。如果你害怕這些化學(xué)物質(zhì)會(huì)損害細(xì)菌的生長(zhǎng)，那么你可以嘗試?yán)脺囟日T導(dǎo)的載體，如：pDH2。它利用PL啟動(dòng)子，在溫度上升到42℃后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。                   
可以看到在所有啟動(dòng)子里屬T7啟動(dòng)子最強(qiáng)，它可以將大腸桿菌的資源最大程度地調(diào)用過(guò)來(lái)表達(dá)外源蛋白。這樣一些難表達(dá)的蛋白都可以在pET系統(tǒng)里面表達(dá)出來(lái)，但是是不是越強(qiáng)就越好呢？如果你需要表達(dá)蛋白是可溶的，那么T7啟動(dòng)子就不那么適合了。較弱的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄速度較慢，這樣對(duì)于表達(dá)可溶、穩(wěn)定、完整的蛋白比較有利。                   
Novagen可以說(shuō)是的pET系統(tǒng)是最王牌的T7啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)，可是當(dāng)T7啟動(dòng)子的強(qiáng)啟動(dòng)效應(yīng)不受歡迎的時(shí)候怎么辦呢？在這里給讀者留個(gè)小小的疑問(wèn)，看看大家有沒(méi)有仔細(xì)看筆者寫(xiě)的Novagen篇。提示一下，雖然它轉(zhuǎn)錄速度快，但是可以控制它的拷貝數(shù)，又或者是……利用這些原理Novagen載體也可以毒性高的外源蛋白。                   
載體上除了啟動(dòng)子這個(gè)需要注意之外，另外一個(gè)就是標(biāo)簽了。很多標(biāo)簽是為了增加蛋白的可溶性，也有一些是為了方便鑒定表達(dá)產(chǎn)物，所以在表達(dá)時(shí)可以選擇加標(biāo)簽。是否加標(biāo)簽要看個(gè)人需要，筆者認(rèn)為如果是表達(dá)一個(gè)人家沒(méi)表達(dá)過(guò)的蛋白最好還是加標(biāo)簽，這樣方便將來(lái)鑒定。如果從經(jīng)濟(jì)角度考慮最好加入6×組氨酸標(biāo)簽，筆者曾經(jīng)以為加什么標(biāo)簽都無(wú)所謂（前提是不需要融合表達(dá)），結(jié)果加了個(gè)Novagen的T7•Tag，等到鑒定的時(shí)候發(fā)現(xiàn)單抗那么貴。而且還不好買(mǎi)的，一些較少人用的標(biāo)簽會(huì)讓你很傷腦筋。這也是表達(dá)前要準(zhǔn)備的功課之一哦。                 
  好了，如果你選好了載體，那么下一步就是設(shè)計(jì)引物的。相信大多數(shù)人都是利用PCR把目的基因調(diào)出來(lái)的吧。設(shè)計(jì)引物可以使用一下兩個(gè)軟件，Primer     Premier或者Oligo。如果要表達(dá)全長(zhǎng)，其實(shí)也就沒(méi)那么多要考慮，從一頭一尾找至少8個(gè)匹配序列在加上與載體匹配的序列就可以了。不過(guò)，我還是有以下幾點(diǎn)提醒一下各位：    1、這一點(diǎn)其實(shí)很容易理解，但是有時(shí)也容易被遺忘。那就是先查查表達(dá)外源片段中含有什么內(nèi)切酶位點(diǎn)，不要設(shè)計(jì)重了，否則酶切時(shí)發(fā)現(xiàn)怎么老是有預(yù)期外的小片段出現(xiàn)。2、根據(jù)載體上的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，現(xiàn)在許多類似T載原理的克隆方法也可以應(yīng)用到原核表達(dá)中了，如果T載克隆方法要定向很多時(shí)候要多加4個(gè)堿基，設(shè)計(jì)引物時(shí)候可別忘了加。在設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)的5’端不要忘了加保護(hù)堿基，不同內(nèi)切酶所需的保護(hù)堿基不同，SalⅠ不需要保護(hù)堿基，EcoRⅤ需要1個(gè)，NotⅠ需要2個(gè)，HindⅢ最好有3個(gè)。一般情況下，都設(shè)計(jì)2個(gè)。3、注意啟始密碼子和終止密碼子的讀碼框。如果載體上有ATG可以不另外加了，但是通常ATG后不是緊跟外源片段的，如果中間含有載體序列，務(wù)必確定中間這段序列不會(huì)造成你外源序列的移碼。按情況需要，可以加1到2個(gè)堿基在引物中使讀碼框正確。有始有終，同樣正常的終止密碼子才能保證蛋白的產(chǎn)出。大部分載體也有終止密碼子，如果你對(duì)載體的不放心，也可以在引物中設(shè)計(jì)上終止密碼子，這樣萬(wàn)無(wú)一失。4、還有就是設(shè)計(jì)一對(duì)引物需要注意的地方：一對(duì)引物之間Tm值相差不宜過(guò)大，能一樣最好；一對(duì)引物不宜形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)、互相配對(duì)，若配對(duì)時(shí)最好不要是G-C的結(jié)合（可以用軟件分析）；3'端以G、C結(jié)尾為宜等等。如果要詳細(xì)研究可以看一下PCR技術(shù)的相關(guān)書(shū)籍，很厚。還有就是記得把上游引物設(shè)計(jì)成有義鏈，下游設(shè)計(jì)成反義鏈，否則就沒(méi)有片段出現(xiàn)了。雖然這是很小的地方，可是經(jīng)常會(huì)被忽略。5、如果你是進(jìn)行截取表達(dá)，那么除了之前提到的要注意截取親水區(qū)，還有一點(diǎn)就是對(duì)密碼子的使用頻率進(jìn)行分析。如果在大腸桿菌中使用較少的密碼子在外源片段中連續(xù)出現(xiàn)，還是避開(kāi)它為上策。 
  看完這么多是不是覺(jué)得有點(diǎn)思緒萬(wàn)千呢。以前給我上課的一位教授說(shuō)過(guò)，做試驗(yàn)，那要大膽設(shè)計(jì)，小心求證。快去合成引物開(kāi)始表達(dá)吧。萬(wàn)一表達(dá)不出來(lái)，還有下篇呢。"

如果實(shí)在是找不到原因，那么就把實(shí)驗(yàn)按照標(biāo)準(zhǔn)的流程再做一次，更換全部試劑，因?yàn)橛袝r(shí)候原因是我們無(wú)法想到的，不如重新開(kāi)始！

贊一下(2人)

回復(fù)此樓

51樓2013-07-06 21:45:40

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

田大猜

新蟲(chóng) (初入文壇)

應(yīng)助: 0 (幼兒園)
金幣: 16
帖子: 1
在線: 11.8小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 10224450
注冊(cè): 2018-09-10
性別: MM
專業(yè): 生物化學(xué)

引用回帖:

5樓: Originally posted by dshlove at 2013-06-07 10:37:23
其實(shí)，你不能通過(guò)SDS-PAGE就判斷有沒(méi)有表達(dá)，有的蛋白表達(dá)量是很少的，膠上是看不出來(lái)的。如果有標(biāo)簽的話，先富集下就能看得出來(lái)了�；蛘呦駱巧纤f(shuō)的做WB。

我想問(wèn)一下，怎么樣富集啊

贊一下

回復(fù)此樓

52樓2020-01-06 21:05:41

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn) 我要訂閱樓主 sherrysure 的主題更新

返回列表

上一頁(yè)

普通表情龍兔虎貓

最具人氣熱帖推薦 [查看全部]		作者	回/看	最后發(fā)表

[基金申請(qǐng)] 請(qǐng)教下大家 2026年國(guó)家基金申請(qǐng)是雙盲審嗎？ +3	lishucheng1 2026-03-22	5/250	2026-03-24 08:22 by gltch
[考研] 276求調(diào)劑。有半年電池和半年高分子實(shí)習(xí)經(jīng)歷 +9	材料學(xué)257求調(diào)劑 2026-03-23	10/500	2026-03-24 07:36 by wangy0907
[考研] 299求調(diào)劑 +5	某某某某位 2026-03-21	5/250	2026-03-23 23:36 by 熱情沙漠
[考研] 材料專碩找調(diào)劑 +3	哈哈哈吼吼吼哈 2026-03-23	3/150	2026-03-23 23:13 by peike
[考研] 384求調(diào)劑 +3	子系博 2026-03-22	6/300	2026-03-23 21:45 by 子系博
[考研] 一志愿中國(guó)石油大學(xué)（華東）本科齊魯工業(yè)大學(xué) +4	石能偉 2026-03-17	4/200	2026-03-23 17:51 by 17862566385
[考研] 求調(diào)劑一志愿武漢理工大學(xué)材料工程（085601） +3	WW.' 2026-03-23	5/250	2026-03-23 17:18 by 楓翼ljj
[考研] 0854電子信息求調(diào)劑 324 +3	Promise-jyl 2026-03-23	3/150	2026-03-23 13:43 by wangkm
[考研] 291求調(diào)劑 +5	孅華 2026-03-22	5/250	2026-03-23 09:20 by haoshis
[考研] 269專碩求調(diào)劑 +6	金恩貝 2026-03-21	6/300	2026-03-22 14:31 by ColorlessPI
[考研] 一志愿華中科技大學(xué)071000，求調(diào)劑 +4	沿岸有貝殼6 2026-03-21	4/200	2026-03-22 07:21 by ilovexiaobin
[考研] 材料求調(diào)劑 +5	@taotao 2026-03-21	5/250	2026-03-21 20:55 by lbsjt
[考研] 考研調(diào)劑 +3	呼呼？~+123456 2026-03-21	3/150	2026-03-21 20:04 by 無(wú)際的草原
[考研] 一志愿東華大學(xué)控制學(xué)碩320求調(diào)劑 +3	Grand777 2026-03-21	3/150	2026-03-21 19:23 by 簡(jiǎn)之-
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +4	妮妮ninicgb 2026-03-21	4/200	2026-03-21 18:39 by 學(xué)員8dgXkO
[考研] 330求調(diào)劑0854 +3	assdll 2026-03-21	3/150	2026-03-21 13:01 by 搏擊518
[考研] 材料學(xué)學(xué)碩080502 337求調(diào)劑-一志愿華中科技大學(xué) +4	順順順mr 2026-03-18	5/250	2026-03-21 10:22 by luoyongfeng
[考研] 295材料求調(diào)劑，一志愿武漢理工085601專碩 +5	Charlieyq 2026-03-19	5/250	2026-03-20 20:35 by JourneyLucky
[考研] 一志愿吉林大學(xué)材料學(xué)碩321求調(diào)劑 +11	Ymlll 2026-03-18	15/750	2026-03-20 19:40 by 丁丁*
[論文投稿] 申請(qǐng)回稿延期一個(gè)月，編輯同意了。但系統(tǒng)上的時(shí)間沒(méi)變，給編輯又寫(xiě)郵件了，沒(méi)回復(fù) 10+3	wangf9518 2026-03-17	4/200	2026-03-19 23:55 by babero

亭亭五月天在线观看,亭亭五月天在线观看,国产最新av一区二区,国产 高清 中文字幕,99re热久久亚洲综合精品成人,熟妇 一区二区三区,一级做a爰片性色毛片武则天,美女的骚穴视频播放,国产美女午夜免费视频

24小時(shí)熱門(mén)版塊排行榜

凌波麗

【答案】應(yīng)助回帖

田大猜

亭亭五月天在线观看,亭亭五月天在线观看,国产最新av一区二区,国产高清中文字幕,99re热久久亚洲综合精品成人,熟妇一区二区三区,一级做a爰片性色毛片武则天,美女的骚穴视频播放,国产美女午夜免费视频