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sherrysure

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[求助] 我的蛋白序列鑒定都是正確的，可是為什么就是不表達(dá)，是為什么呢？附SDS-PAGE圖

這3個月一直在做蛋白表達(dá)，
但是一直沒有成功。
我是這樣做的：
把擴(kuò)增出來的目的條帶連接到pMD18TSimple，轉(zhuǎn)化到Top10；
選擇PCR與測序鑒定結(jié)果都正確的陽性菌液，提質(zhì)粒，酶切，回收目的條帶；
酶切后目的條帶連接到pET30a載體，轉(zhuǎn)化到Rosetta；
菌液PCR和測序鑒定結(jié)果正確的陽性菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，在0、2、4、6、8h取樣做SDS-PAGE；
得到的結(jié)果就是沒有結(jié)果

期間也試過以下表達(dá)載體：pET28b、pET30a、pET32a
選擇的酶切位點是BamHI、XhoI，都對應(yīng)載體圖譜數(shù)過，不會存在移碼的問題。
分別也都嘗試過感受態(tài)：BL21、Rosetta
但是結(jié)果都是不表達(dá)，跑出來與上面類似的圖

迫切尋求幫助，請求高手指導(dǎo)~~感激不盡！

我的蛋白序列鑒定都是正確的，可是為什么就是不表達(dá)，是為什么呢？附SDS-PAGE圖

page.jpg

[ Last edited by sherrysure on 2013-6-6 at 14:47 ]

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1樓 2013-06-06 14:31:12

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【答案】應(yīng)助回帖

2010年時，我從網(wǎng)上摘錄的一份材料，樓主可以參考.
"原核表達(dá)個人秘笈：表達(dá)前的分析比什么都重要

http://www.freeduan.com/viewthre ... ;amp;extra=page%3D1
表達(dá)不同于其它一些實驗，比如：提取質(zhì)粒、PCR、電鏡切片，這些人為控制的因素比較多，出問題相對來說也比較好分析。表達(dá)呢，你把質(zhì)�？寺『美玻唤o細(xì)胞，然后有些事情就不全是你要怎樣就怎樣了。原核表達(dá)在表達(dá)當(dāng)中來說還是比較簡單，細(xì)菌培養(yǎng)條件簡單、生長速度快，需要的儀器和培養(yǎng)基都比較便宜。當(dāng)然，它也存在一些缺乏高級修飾、細(xì)胞內(nèi)部還原性過高等缺點。                    原核表達(dá)從一開始的設(shè)計就非常重要，所謂好的開始是成功的一半。做足準(zhǔn)備功夫，可是省去很多將來后悔的事情。首先，我們要根據(jù)是否要求可溶將載體分成兩大類，如果希望可以同時嘗試多種表達(dá)系統(tǒng)，也有許多商業(yè)化的系統(tǒng)供選擇。                    前面已經(jīng)介紹過許多公司的商業(yè)化載體、菌株和多系統(tǒng)表達(dá)體系，現(xiàn)在我想先從自己的蛋白分析講起。同樣的載體、同樣的系統(tǒng)，很可能表達(dá)這個蛋白表達(dá)量奇高，但是另外一個就是做不出來，所以沒有萬能的載體，只有永恒的分析。當(dāng)然如果你的蛋白曾經(jīng)在原核系統(tǒng)中成功表達(dá)出來那是最好的，選擇同樣的載體表達(dá)成功率會高很多。如果沒有也最好嘗試找一些曾經(jīng)表達(dá)過和你的蛋白擁有相類似結(jié)構(gòu)的文獻(xiàn)。比如大部分含有哺乳動物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列載體表達(dá)出來的。根據(jù)經(jīng)驗而言，含有較少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小為60kD的單體蛋白較容易表達(dá)。          
在下面將列出幾個影響表達(dá)的因素，大家可以在表達(dá)前根據(jù)這幾個因素自己分析一下：            
  1、翻譯起始位點    現(xiàn)在大部分的表達(dá)載體都提供起始位點，所以它已經(jīng)把起始密碼子與核糖體結(jié)合位點的距離進(jìn)行優(yōu)化了，一般情況下不需要自己再加，不過還是要留意載體圖譜上是否注明有起始密碼子和終止密碼子
2、GC含量    表達(dá)序列中的GC含量超過70％的時候可能會降低蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)水平。GC含量可以利用DNA STAR、Vector NTI Suite等軟件進(jìn)行預(yù)測。
3、二級結(jié)構(gòu)    在起始密碼子附近的mRNA二級結(jié)構(gòu)可能會抑制翻譯的起始或者造成翻譯暫停從而產(chǎn)生不完全的蛋白。如果利用軟件分析DNA或RNA結(jié)構(gòu)上有柄（stem）結(jié)構(gòu)，并且結(jié)合長度超過8個堿基，這種結(jié)構(gòu)會因為位點專一突變等因素而變得不穩(wěn)定。
4、基因或者蛋白的大小    一般說來小于5kD或者大于100kD的蛋白都是難以表達(dá)的。蛋白越小，越容易被降解。在這種情況下可以采取串聯(lián)表達(dá)，在每個表達(dá)單位（即單體蛋白）間設(shè)計蛋白水解或者是化學(xué)斷裂位點。如果蛋白較小，那么加入融合標(biāo)簽GST、Trx、MBP或者其它較大的促進(jìn)融合的蛋白標(biāo)簽就較有可能使蛋白正確折疊，并以融合形式表達(dá)。                
 對于另一個極端，大于60kD的蛋白建議使用較小的標(biāo)簽，如6×組氨酸標(biāo)簽。對于結(jié)構(gòu)研究較清楚的蛋白可以采取截取表達(dá)。當(dāng)然表達(dá)時要根據(jù)目的進(jìn)行截取，如果是要進(jìn)行抗體制備而截取，那么一定要保證截取的部位抗原性較強(qiáng)。對于抗原性也可以利用軟件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在線軟件，不過在分析之余也要認(rèn)識到這是一種數(shù)據(jù)統(tǒng)計的結(jié)論，如果蛋白和免疫動物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的話還是不妨一試的。5、親疏水性    這也是一種經(jīng)驗之談，相信經(jīng)常做表達(dá)的人都發(fā)現(xiàn)表達(dá)親水區(qū)域時表達(dá)量會比較高，如果你要表達(dá)一個膜蛋白，那么勸你做好長期抗戰(zhàn)的準(zhǔn)備吧。有許多軟件可以對氨基酸的親疏水性進(jìn)行分析，比如Vector NIT Suite，除此之外還可以利用在線跨膜區(qū)預(yù)測軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ 對跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測。對于自己表達(dá)的蛋白有所了解后就可以開始對載體進(jìn)行選擇了，目前商業(yè)化的載體基本上包含以下幾個元件：    除了上面標(biāo)出的元件外還需要有復(fù)制起點，它對于控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)非常重要；另外就是篩選標(biāo)記了，比如藍(lán)白斑篩選的lacZ，各種抗生素標(biāo)記。在以上幾個元件中，我們需要注意的是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)與啟動的元件，也就是調(diào)控子和啟動子。其中啟動子對于蛋白表達(dá)的速度起著舉足輕重的作用，它與最終蛋白的表達(dá)量、是否可融密不可分。這里，對于世面上廣泛銷售的幾種原核表達(dá)載體使用的啟動子進(jìn)行總結(jié)。                  
啟動子來源調(diào)控手段（濃度）強(qiáng)度                
   LacUV5 乳糖操縱元 lacI/IPTG (0.1-1mM) 強(qiáng)                 
 Trp 色氨酸操縱元 trpR 3-β-吲哚丙烯酸強(qiáng)                 
 Tac 結(jié)合了色氨酸啟動子的-35序列和乳糖啟動子的-10序列
lacI/IPTG (0.1-1mM) 強(qiáng)                 
 PL λ噬菌體 λcI阻遏物/溫度強(qiáng)                 
 噬菌體T5 T5噬菌體 lacI/IPTG (0.1-1mM) 強(qiáng)                   
pBAD 阿拉伯糖操縱元 AraBAD/阿拉伯糖（1μm-10mM）嚴(yán)謹(jǐn)                 
 T7 T7 RNA聚合酶 lacI/IPTG (0.1-1mM) 非常強(qiáng)                    
乳糖操縱子是應(yīng)用最廣泛的調(diào)控模式，除了IPTG這種化學(xué)誘導(dǎo)方式之外還有利用吲哚丙烯酸和阿拉伯糖的化學(xué)誘導(dǎo)。如果你害怕這些化學(xué)物質(zhì)會損害細(xì)菌的生長，那么你可以嘗試?yán)脺囟日T導(dǎo)的載體，如：pDH2。它利用PL啟動子，在溫度上升到42℃后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。                   
可以看到在所有啟動子里屬T7啟動子最強(qiáng)，它可以將大腸桿菌的資源最大程度地調(diào)用過來表達(dá)外源蛋白。這樣一些難表達(dá)的蛋白都可以在pET系統(tǒng)里面表達(dá)出來，但是是不是越強(qiáng)就越好呢？如果你需要表達(dá)蛋白是可溶的，那么T7啟動子就不那么適合了。較弱的啟動子轉(zhuǎn)錄速度較慢，這樣對于表達(dá)可溶、穩(wěn)定、完整的蛋白比較有利。                   
Novagen可以說是的pET系統(tǒng)是最王牌的T7啟動子表達(dá)系統(tǒng)，可是當(dāng)T7啟動子的強(qiáng)啟動效應(yīng)不受歡迎的時候怎么辦呢？在這里給讀者留個小小的疑問，看看大家有沒有仔細(xì)看筆者寫的Novagen篇。提示一下，雖然它轉(zhuǎn)錄速度快，但是可以控制它的拷貝數(shù)，又或者是……利用這些原理Novagen載體也可以毒性高的外源蛋白。                   
載體上除了啟動子這個需要注意之外，另外一個就是標(biāo)簽了。很多標(biāo)簽是為了增加蛋白的可溶性，也有一些是為了方便鑒定表達(dá)產(chǎn)物，所以在表達(dá)時可以選擇加標(biāo)簽。是否加標(biāo)簽要看個人需要，筆者認(rèn)為如果是表達(dá)一個人家沒表達(dá)過的蛋白最好還是加標(biāo)簽，這樣方便將來鑒定。如果從經(jīng)濟(jì)角度考慮最好加入6×組氨酸標(biāo)簽，筆者曾經(jīng)以為加什么標(biāo)簽都無所謂（前提是不需要融合表達(dá)），結(jié)果加了個Novagen的T7•Tag，等到鑒定的時候發(fā)現(xiàn)單抗那么貴。而且還不好買的，一些較少人用的標(biāo)簽會讓你很傷腦筋。這也是表達(dá)前要準(zhǔn)備的功課之一哦。                 
  好了，如果你選好了載體，那么下一步就是設(shè)計引物的。相信大多數(shù)人都是利用PCR把目的基因調(diào)出來的吧。設(shè)計引物可以使用一下兩個軟件，Primer     Premier或者Oligo。如果要表達(dá)全長，其實也就沒那么多要考慮，從一頭一尾找至少8個匹配序列在加上與載體匹配的序列就可以了。不過，我還是有以下幾點提醒一下各位：    1、這一點其實很容易理解，但是有時也容易被遺忘。那就是先查查表達(dá)外源片段中含有什么內(nèi)切酶位點，不要設(shè)計重了，否則酶切時發(fā)現(xiàn)怎么老是有預(yù)期外的小片段出現(xiàn)。2、根據(jù)載體上的酶切位點設(shè)計引物，現(xiàn)在許多類似T載原理的克隆方法也可以應(yīng)用到原核表達(dá)中了，如果T載克隆方法要定向很多時候要多加4個堿基，設(shè)計引物時候可別忘了加。在設(shè)計酶切位點的5’端不要忘了加保護(hù)堿基，不同內(nèi)切酶所需的保護(hù)堿基不同，SalⅠ不需要保護(hù)堿基，EcoRⅤ需要1個，NotⅠ需要2個，HindⅢ最好有3個。一般情況下，都設(shè)計2個。3、注意啟始密碼子和終止密碼子的讀碼框。如果載體上有ATG可以不另外加了，但是通常ATG后不是緊跟外源片段的，如果中間含有載體序列，務(wù)必確定中間這段序列不會造成你外源序列的移碼。按情況需要，可以加1到2個堿基在引物中使讀碼框正確。有始有終，同樣正常的終止密碼子才能保證蛋白的產(chǎn)出。大部分載體也有終止密碼子，如果你對載體的不放心，也可以在引物中設(shè)計上終止密碼子，這樣萬無一失。4、還有就是設(shè)計一對引物需要注意的地方：一對引物之間Tm值相差不宜過大，能一樣最好；一對引物不宜形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)、互相配對，若配對時最好不要是G-C的結(jié)合（可以用軟件分析）；3'端以G、C結(jié)尾為宜等等。如果要詳細(xì)研究可以看一下PCR技術(shù)的相關(guān)書籍，很厚。還有就是記得把上游引物設(shè)計成有義鏈，下游設(shè)計成反義鏈，否則就沒有片段出現(xiàn)了。雖然這是很小的地方，可是經(jīng)常會被忽略。5、如果你是進(jìn)行截取表達(dá)，那么除了之前提到的要注意截取親水區(qū)，還有一點就是對密碼子的使用頻率進(jìn)行分析。如果在大腸桿菌中使用較少的密碼子在外源片段中連續(xù)出現(xiàn)，還是避開它為上策。 
  看完這么多是不是覺得有點思緒萬千呢。以前給我上課的一位教授說過，做試驗，那要大膽設(shè)計，小心求證。快去合成引物開始表達(dá)吧。萬一表達(dá)不出來，還有下篇呢。"

如果實在是找不到原因，那么就把實驗按照標(biāo)準(zhǔn)的流程再做一次，更換全部試劑，因為有時候原因是我們無法想到的，不如重新開始！

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51樓2013-07-06 21:45:40

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myprayer: 金幣+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-07-05 08:24:35

低溫誘導(dǎo)?16度過夜試試?難道是包涵體么?轉(zhuǎn)速降低一點.包涵體是看不出來的,你超聲破碎,分別跑上清和沉淀試試吧..

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10樓2013-06-07 23:14:58

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xiaoweiwei121

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引用回帖:

20樓: Originally posted by sherrysure at 2013-06-08 11:05:38
這個蛋白是以包涵體存在的。我查了一下，長時間低溫誘導(dǎo)的作用是減少包涵體的形成。那么我的蛋白表達(dá)量是不是也會減少呢？...

個人認(rèn)為吧，你還是先不要考慮這么多如溫度影響表達(dá)量啊，以后蛋白量夠不夠啊之類的問題，現(xiàn)在先考慮的是如何能看到蛋白表達(dá)，只有蛋白表達(dá)了，才能說以后的話

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27樓2013-06-09 01:42:08

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普通回帖

linxt2005

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sherrysure(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖應(yīng)助！ 2013-06-07 01:50:57

沒有提到誘導(dǎo)，應(yīng)該只是忘了寫吧？

個人覺得首先需要明確的是并不是所有的外源基因在某一宿主菌內(nèi)都能得到成功表達(dá)。
樓主的問題我覺得可以這么驗證一下：
1. 先把操作講清楚些，比如表達(dá)時可有設(shè)置陰性對照，電泳樣品是如何制樣的？
2. 可以先進(jìn)行WB分析一下。

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小兵一個

2樓2013-06-06 16:48:10

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sherrysure

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引用回帖:

2樓: Originally posted by linxt2005 at 2013-06-06 16:48:10
沒有提到誘導(dǎo)，應(yīng)該只是忘了寫吧？

個人覺得首先需要明確的是并不是所有的外源基因在某一宿主菌內(nèi)都能得到成功表達(dá)。
樓主的問題我覺得可以這么驗證一下：
1. 先把操作講清楚些，比如表達(dá)時可有設(shè)置陰性對照， ...

恩，是忘記寫了，誘導(dǎo)IPTG濃度0.7，又到溫度30度，之前驗證過這個IPTG確定是好用的，這個溫度和濃度我想應(yīng)該不存在問題吧。至于電泳樣品的制備，個人認(rèn)為應(yīng)該也不會存在什么問題，因為也用別人構(gòu)建成功的質(zhì)粒跑過一次PAGE，結(jié)果是正常的，所以我想因該可以排除試劑和個人操作原因吧。

上面的PAGE圖從右到左分別是Marker,0,2,4,6,8h。
之前也跑過空載，結(jié)果也是一樣的。
至于WB，目前還沒有試過，請問page沒有結(jié)果的話WB怎么分析呢？

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3樓2013-06-06 18:20:27

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【答案】應(yīng)助回帖

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kx444555: 金幣+1, 鼓勵交流 2013-06-11 21:13:05

引用回帖:

3樓: Originally posted by sherrysure at 2013-06-06 18:20:27
恩，是忘記寫了，誘導(dǎo)IPTG濃度0.7，又到溫度30度，之前驗證過這個IPTG確定是好用的，這個溫度和濃度我想應(yīng)該不存在問題吧。至于電泳樣品的制備，個人認(rèn)為應(yīng)該也不會存在什么問題，因為也用別人構(gòu)建成功的質(zhì)粒跑過一 ...

如果有很低的表達(dá)，page上是看不出來了，而WB敏感性很強(qiáng)的，可以檢測到很低的表達(dá)，所以page看不出來，做WB還是有意義的

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4樓2013-06-06 23:59:39

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sherrysure(myprayer代發(fā)): 金幣+1, 贈人玫瑰手有余香，感謝你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-08 08:51:17

其實，你不能通過SDS-PAGE就判斷有沒有表達(dá)，有的蛋白表達(dá)量是很少的，膠上是看不出來的。如果有標(biāo)簽的話，先富集下就能看得出來了。或者像樓上所說的做WB。

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5樓2013-06-07 10:37:23

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sherrysure(myprayer代發(fā)): 金幣+1, 贈人玫瑰手有余香，感謝你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-08 08:51:02

幾點小建議1. WB檢測標(biāo)簽。 2. 你做寄生蟲學(xué)，看看你的寄生蟲有沒有特殊密碼子偏好或結(jié)構(gòu)，這個密碼子適合大腸表達(dá)不，rosetta有時候也不能滿足。3. 文獻(xiàn)找同源蛋白，看看別人做的是哪一段的克隆。4. 跑膠上樣少一點，這樣看的清楚，從上到下全黑，難以分辨。祝順利。

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6樓2013-06-07 13:57:43

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你的誘導(dǎo)溫度是不是有點高，我用20~25℃

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believe yourself！

7樓2013-06-07 14:39:38

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zx1984

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將IPTG和溫度都設(shè)定梯度篩選，試試吧，一般都要設(shè)梯度篩選，你的條件是比較大眾化的，有的不一定合適。

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8樓2013-06-07 16:37:07

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cynthia8225

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myprayer: 金幣+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-07-05 08:24:44

IPTG的濃度還是篩選下吧。。。我的都到1mM了。。。

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9樓2013-06-07 22:09:39

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