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sherrysure銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
我的蛋白序列鑒定都是正確的，可是為什么就是不表達，是為什么呢？附SDS-PAGE圖
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這3個月一直在做蛋白表達， 但是一直沒有成功。 我是這樣做的： 把擴增出來的目的條帶連接到pMD18TSimple，轉化到Top10； 選擇PCR與測序鑒定結果都正確的陽性菌液，提質(zhì)粒，酶切，回收目的條帶； 酶切后目的條帶連接到pET30a載體，轉化到Rosetta； 菌液PCR和測序鑒定結果正確的陽性菌液擴大培養(yǎng)，在0、2、4、6、8h取樣做SDS-PAGE； 得到的結果就是沒有結果  期間也試過以下表達載體：pET28b、pET30a、pET32a 選擇的酶切位點是BamHI、XhoI，都對應載體圖譜數(shù)過，不會存在移碼的問題。 分別也都嘗試過感受態(tài)：BL21、Rosetta 但是結果都是不表達，跑出來與上面類似的圖 迫切尋求幫助，請求高手指導~~感激不盡！ page.jpg [ Last edited by sherrysure on 2013-6-6 at 14:47 ] |
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 核酸生物學實驗經(jīng)驗 | 蛋白質(zhì)生物學實驗經(jīng)驗 |
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【答案】應助回帖
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2010年時，我從網(wǎng)上摘錄的一份材料，樓主可以參考. "原核表達個人秘笈：表達前的分析比什么都重要 http://www.freeduan.com/viewthre ... ;amp;extra=page%3D1 表達不同于其它一些實驗，比如：提取質(zhì)粒、PCR、電鏡切片，這些人為控制的因素比較多，出問題相對來說也比較好分析。表達呢，你把質(zhì)�？寺『美�，交給細胞，然后有些事情就不全是你要怎樣就怎樣了。原核表達在表達當中來說還是比較簡單，細菌培養(yǎng)條件簡單、生長速度快，需要的儀器和培養(yǎng)基都比較便宜。當然，它也存在一些缺乏高級修飾、細胞內(nèi)部還原性過高等缺點。 原核表達從一開始的設計就非常重要，所謂好的開始是成功的一半。做足準備功夫，可是省去很多將來后悔的事情。首先，我們要根據(jù)是否要求可溶將載體分成兩大類，如果希望可以同時嘗試多種表達系統(tǒng)，也有許多商業(yè)化的系統(tǒng)供選擇。 前面已經(jīng)介紹過許多公司的商業(yè)化載體、菌株和多系統(tǒng)表達體系，現(xiàn)在我想先從自己的蛋白分析講起。同樣的載體、同樣的系統(tǒng)，很可能表達這個蛋白表達量奇高，但是另外一個就是做不出來，所以沒有萬能的載體，只有永恒的分析。當然如果你的蛋白曾經(jīng)在原核系統(tǒng)中成功表達出來那是最好的，選擇同樣的載體表達成功率會高很多。如果沒有也最好嘗試找一些曾經(jīng)表達過和你的蛋白擁有相類似結構的文獻。比如大部分含有哺乳動物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列載體表達出來的。根據(jù)經(jīng)驗而言，含有較少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小為60kD的單體蛋白較容易表達。 在下面將列出幾個影響表達的因素，大家可以在表達前根據(jù)這幾個因素自己分析一下： 1、翻譯起始位點 現(xiàn)在大部分的表達載體都提供起始位點，所以它已經(jīng)把起始密碼子與核糖體結合位點的距離進行優(yōu)化了，一般情況下不需要自己再加，不過還是要留意載體圖譜上是否注明有起始密碼子和終止密碼子 2、GC含量 表達序列中的GC含量超過70％的時候可能會降低蛋白在大腸桿菌中的表達水平。GC含量可以利用DNA STAR、Vector NTI Suite等軟件進行預測。 3、二級結構 在起始密碼子附近的mRNA二級結構可能會抑制翻譯的起始或者造成翻譯暫停從而產(chǎn)生不完全的蛋白。如果利用軟件分析DNA或RNA結構上有柄（stem）結構，并且結合長度超過8個堿基，這種結構會因為位點專一突變等因素而變得不穩(wěn)定。 4、基因或者蛋白的大小 一般說來小于5kD或者大于100kD的蛋白都是難以表達的。蛋白越小，越容易被降解。在這種情況下可以采取串聯(lián)表達，在每個表達單位（即單體蛋白）間設計蛋白水解或者是化學斷裂位點。如果蛋白較小，那么加入融合標簽GST、Trx、MBP或者其它較大的促進融合的蛋白標簽就較有可能使蛋白正確折疊，并以融合形式表達。 對于另一個極端，大于60kD的蛋白建議使用較小的標簽，如6×組氨酸標簽。對于結構研究較清楚的蛋白可以采取截取表達。當然表達時要根據(jù)目的進行截取，如果是要進行抗體制備而截取，那么一定要保證截取的部位抗原性較強。對于抗原性也可以利用軟件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在線軟件，不過在分析之余也要認識到這是一種數(shù)據(jù)統(tǒng)計的結論，如果蛋白和免疫動物親緣關系較遠的話還是不妨一試的。5、親疏水性 這也是一種經(jīng)驗之談，相信經(jīng)常做表達的人都發(fā)現(xiàn)表達親水區(qū)域時表達量會比較高，如果你要表達一個膜蛋白，那么勸你做好長期抗戰(zhàn)的準備吧。有許多軟件可以對氨基酸的親疏水性進行分析，比如Vector NIT Suite，除此之外還可以利用在線跨膜區(qū)預測軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ 對跨膜區(qū)進行預測。對于自己表達的蛋白有所了解后就可以開始對載體進行選擇了，目前商業(yè)化的載體基本上包含以下幾個元件： 除了上面標出的元件外還需要有復制起點，它對于控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)非常重要；另外就是篩選標記了，比如藍白斑篩選的lacZ，各種抗生素標記。在以上幾個元件中，我們需要注意的是負責調(diào)節(jié)與啟動的元件，也就是調(diào)控子和啟動子。其中啟動子對于蛋白表達的速度起著舉足輕重的作用，它與最終蛋白的表達量、是否可融密不可分。這里，對于世面上廣泛銷售的幾種原核表達載體使用的啟動子進行總結。 啟動子 來源 調(diào)控手段（濃度） 強度 LacUV5 乳糖操縱元 lacI/IPTG (0.1-1mM) 強 Trp 色氨酸操縱元 trpR 3-β-吲哚丙烯酸 強 Tac 結合了色氨酸啟動子的-35序列和乳糖啟動子的-10序列 lacI/IPTG (0.1-1mM) 強 PL λ噬菌體 λcI阻遏物/溫度 強 噬菌體T5 T5噬菌體 lacI/IPTG (0.1-1mM) 強 pBAD 阿拉伯糖操縱元 AraBAD/阿拉伯糖（1μm-10mM） 嚴謹 T7 T7 RNA聚合酶 lacI/IPTG (0.1-1mM) 非常強 乳糖操縱子是應用最廣泛的調(diào)控模式，除了IPTG這種化學誘導方式之外還有利用吲哚丙烯酸和阿拉伯糖的化學誘導。如果你害怕這些化學物質(zhì)會損害細菌的生長，那么你可以嘗試利用溫度誘導的載體，如：pDH2。它利用PL啟動子，在溫度上升到42℃后進行誘導表達。 可以看到在所有啟動子里屬T7啟動子最強，它可以將大腸桿菌的資源最大程度地調(diào)用過來表達外源蛋白。這樣一些難表達的蛋白都可以在pET系統(tǒng)里面表達出來，但是是不是越強就越好呢？如果你需要表達蛋白是可溶的，那么T7啟動子就不那么適合了。較弱的啟動子轉錄速度較慢，這樣對于表達可溶、穩(wěn)定、完整的蛋白比較有利。 Novagen可以說是的pET系統(tǒng)是最王牌的T7啟動子表達系統(tǒng)，可是當T7啟動子的強啟動效應不受歡迎的時候怎么辦呢？在這里給讀者留個小小的疑問，看看大家有沒有仔細看筆者寫的Novagen篇。提示一下，雖然它轉錄速度快，但是可以控制它的拷貝數(shù)，又或者是……利用這些原理Novagen載體也可以毒性高的外源蛋白。 載體上除了啟動子這個需要注意之外，另外一個就是標簽了。很多標簽是為了增加蛋白的可溶性，也有一些是為了方便鑒定表達產(chǎn)物，所以在表達時可以選擇加標簽。是否加標簽要看個人需要，筆者認為如果是表達一個人家沒表達過的蛋白最好還是加標簽，這樣方便將來鑒定。如果從經(jīng)濟角度考慮最好加入6×組氨酸標簽，筆者曾經(jīng)以為加什么標簽都無所謂（前提是不需要融合表達），結果加了個Novagen的T7•Tag，等到鑒定的時候發(fā)現(xiàn)單抗那么貴。而且還不好買的，一些較少人用的標簽會讓你很傷腦筋。這也是表達前要準備的功課之一哦。 好了，如果你選好了載體，那么下一步就是設計引物的。相信大多數(shù)人都是利用PCR把目的基因調(diào)出來的吧。設計引物可以使用一下兩個軟件，Primer Premier或者Oligo。如果要表達全長，其實也就沒那么多要考慮，從一頭一尾找至少8個匹配序列在加上與載體匹配的序列就可以了。不過，我還是有以下幾點提醒一下各位： 1、這一點其實很容易理解，但是有時也容易被遺忘。那就是先查查表達外源片段中含有什么內(nèi)切酶位點，不要設計重了，否則酶切時發(fā)現(xiàn)怎么老是有預期外的小片段出現(xiàn)。2、根據(jù)載體上的酶切位點設計引物，現(xiàn)在許多類似T載原理的克隆方法也可以應用到原核表達中了，如果T載克隆方法要定向很多時候要多加4個堿基，設計引物時候可別忘了加。在設計酶切位點的5’端不要忘了加保護堿基，不同內(nèi)切酶所需的保護堿基不同，SalⅠ不需要保護堿基，EcoRⅤ需要1個，NotⅠ需要2個，HindⅢ最好有3個。一般情況下，都設計2個。3、注意啟始密碼子和終止密碼子的讀碼框。如果載體上有ATG可以不另外加了，但是通常ATG后不是緊跟外源片段的，如果中間含有載體序列，務必確定中間這段序列不會造成你外源序列的移碼。按情況需要，可以加1到2個堿基在引物中使讀碼框正確。有始有終，同樣正常的終止密碼子才能保證蛋白的產(chǎn)出。大部分載體也有終止密碼子，如果你對載體的不放心，也可以在引物中設計上終止密碼子，這樣萬無一失。4、還有就是設計一對引物需要注意的地方：一對引物之間Tm值相差不宜過大，能一樣最好；一對引物不宜形成發(fā)夾結構、互相配對，若配對時最好不要是G-C的結合（可以用軟件分析）；3'端以G、C結尾為宜等等。如果要詳細研究可以看一下PCR技術的相關書籍，很厚。還有就是記得把上游引物設計成有義鏈，下游設計成反義鏈，否則就沒有片段出現(xiàn)了。雖然這是很小的地方，可是經(jīng)常會被忽略。5、如果你是進行截取表達，那么除了之前提到的要注意截取親水區(qū)，還有一點就是對密碼子的使用頻率進行分析。如果在大腸桿菌中使用較少的密碼子在外源片段中連續(xù)出現(xiàn)，還是避開它為上策。 看完這么多是不是覺得有點思緒萬千呢。以前給我上課的一位教授說過，做試驗，那要大膽設計，小心求證�？烊ズ铣梢镩_始表達吧。萬一表達不出來，還有下篇呢。" 如果實在是找不到原因，那么就把實驗按照標準的流程再做一次，更換全部試劑，因為有時候原因是我們無法想到的，不如重新開始！ |
51樓2013-07-06 21:45:40
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