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sayerqq新蟲 (初入文壇)
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[求助]
請問哪位可以幫幫我，看看問題出在哪里？
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最近我在用pcDNA3.1-EGFP載體與一個1.8k左右的片段連接，但連接了一個月了，還是沒有連上，想請教一下大家問題出在哪里？ 首先，我講一下我的實驗流程： 1、設(shè)計引物擴增出該基因引物， 2、提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴增目的片段 3、將目的片段膠回收后連入T載體，檢驗正確后測序 4、測序正確后，用EcoR I和Hind III 雙酶切連接了目的條帶的T載體，同時也雙酶切了pcDNA3.1-EGFP載體， 5、膠回收了酶切后的1.8k片段和pcDNA3.1-EGFP切開后的片段 6、T4連接酶過夜連接 7、轉(zhuǎn)化、涂板后挑單克隆 8、菌落pcr鑒定，質(zhì)粒提取鑒定 9、測序鑒定 接下來，我講一下遇到的問題，在第8步的驗證都非常正確，而測序的時候卻總是不對，測序的結(jié)果顯示是一堆大腸桿菌的基因組，我不知道問題出在什么地方，請各位高手指導(dǎo)一下。上傳一下第八步的驗證圖供參考。另外，為什么pcDNA3.1-EGFP與目的片段連接效率怎么這么低呢？我挑了124個單克隆，只出來一個。 L12酶切和質(zhì)粒酶切.jpg PC3.1、L12酶切圖.jpg 菌落PCR.jpg |
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2樓2013-06-12 23:32:43
sayerqq
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6樓2013-07-03 16:37:01
【答案】應(yīng)助回帖
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137167741: 金幣+1, 小木蟲交流，共同進(jìn)步~~ 2013-07-04 08:49:53
137167741: 金幣+1, 小木蟲交流，共同進(jìn)步~~ 2013-07-04 08:49:53
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一百多個得到一個，效率太低了，而且可能轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)表達(dá)都是問題。如果是我的話，我會選擇從頭開始，如果時間安排緊湊三五天就可以完成。 很明顯你的L12沒有任何問題， pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒最好重新轉(zhuǎn)化一下，得到新制備的質(zhì)粒進(jìn)行酶切。可以選擇一個引物測一下質(zhì)粒，保證沒有任何問題。 菌落pcr有時得到很多的假陽性，有時未連接的產(chǎn)物混到了菌落的周圍，得到了錯誤的信號。 下次如果要做的話，PCR鑒定對的，提取質(zhì)粒做個酶切，檢測一下你的插入片段能不能被切下來 祝好運 |
7樓2013-07-04 00:48:40
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