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鐵鷹公爵鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助-兩道分子生物學(xué)習(xí)題答案
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1 已知膜蛋白A和信號蛋白Src存在直接相互作用，物質(zhì)B和蛋白A結(jié)合后， 可誘發(fā)Src磷酸化活化，設(shè)計(jì)至少6個(gè)以上分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)上述發(fā)現(xiàn)。 2 蛋白A是一種分泌蛋白，分子量10kd，等電點(diǎn)4.0，基因克隆中加入HisTag 后，克隆到pET21質(zhì)粒中，用大腸桿菌表達(dá)，設(shè)計(jì)分離方法，將蛋白A純化。 [ Last edited by 1949stone on 2013-6-19 at 07:01 ] |
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鐵鷹公爵
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2樓2013-06-18 22:00:56
1949stone
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3樓2013-06-19 07:00:25
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【答案】應(yīng)助回帖
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鐵鷹公爵(myprayer代發(fā)): 金幣+2, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-19 08:12:44
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我來回答第二道： 蛋白A是一種分泌蛋白是個(gè)陷阱，克隆到pET21質(zhì)粒中，用大腸桿菌表達(dá)后應(yīng)該不能分泌表達(dá)，pET21是個(gè)胞內(nèi)表達(dá)載體，因?yàn)榛蚩寺≈屑尤肓薍isTag，所以可以用Ni-NTA柱親和純化得到目的蛋白。具體方法如下：工程菌誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體，細(xì)胞破碎，離心去沉淀，上清上樣于平衡好的Ni-NTA柱，然后低濃度的咪唑溶液（比如500 mM NaCl, 20 mM phosphate (pH 8.0) and 20 mM imidazole）預(yù)洗，除去非特異性結(jié)合蛋白，然后高濃度咪唑溶液（500 mM NaCl, 20 mM phosphate (pH 8.0) and 500 mM imidazole）洗脫目的蛋白，收集洗脫峰；再透析或者過膜除鹽，濃縮，得到目的蛋白A。 |
4樓2013-06-19 07:56:57
roomofxw
木蟲 (正式寫手)
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5樓2013-06-19 09:11:07
鐵鷹公爵
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6樓2013-06-19 11:57:44
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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1 已知膜蛋白A和信號蛋白Src存在直接相互作用，物質(zhì)B和蛋白A結(jié)合后， 可誘發(fā)Src磷酸化活化，設(shè)計(jì)至少6個(gè)以上分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)上述發(fā)現(xiàn)。 這題，我來回答。 實(shí)質(zhì)上這題分為三個(gè)小問題：1.蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，2.蛋白質(zhì)-小分子相互作用，3.蛋白質(zhì)的磷酸化檢測。 1.蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，2.蛋白質(zhì)-小分子相互作用，都可用NMR，CD，UV，能量轉(zhuǎn)移等。 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用還可以用綠色熒光蛋白，電子顯微鏡直接觀測，X-ray diffraction，質(zhì)譜，原子力顯微鏡觀測，WB等，膜蛋白A和信號蛋白Src的檢測用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究方法研究。 物質(zhì)B是蛋白質(zhì)，研究物質(zhì)B和蛋白A結(jié)合研究用的方法同上。物質(zhì)B是是非蛋白質(zhì)，研究物質(zhì)B和蛋白A結(jié)合研究用的方法按照蛋白質(zhì)-小分子相互作用的研究技術(shù)，用NMR，CD，UV，能量轉(zhuǎn)移等，還可以用有機(jī)熒光試劑標(biāo)記上物質(zhì)B，結(jié)合蛋白A后，觀測蛋白A后的原有的自發(fā)熒光的變化，后者在蛋白A分子表面標(biāo)記上熒光猝滅集團(tuán)，當(dāng)物質(zhì)B，結(jié)合蛋白A前后，用熒光顯微鏡觀測熒光是否發(fā)生猝滅。 3.蛋白質(zhì)的磷酸化檢測。方法很多了，WB----現(xiàn)在有賣的磷酸化的蛋白質(zhì)的當(dāng)克隆抗體。雙向電泳-----在磷酸化前后各做一次。質(zhì)譜直接測定蛋白質(zhì)的磷酸化的分子量變化。NMR測出磷酸化后的蛋白質(zhì)的全構(gòu)象。磷酸化的蛋白質(zhì)的肽譜分析----先有限水解再用二維電泳。X-ray diffraction. 每一種個(gè)問題實(shí)驗(yàn)都是不少于6種方法，1或2 的試驗(yàn)方法與3 是獨(dú)立的，也就1或2 的試驗(yàn)方法與3的試驗(yàn)方法是能夠以不同方式組合起來，那就遠(yuǎn)不止六種了。 |
7樓2013-06-20 12:35:32
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