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關(guān)于RT-qPCR檢測病毒核酸方法的幾個長時間疑惑 已有1人參與
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眾所周知，采用RT-qPCR方法對病毒核酸進行定性檢測是很常用的方法，但有幾個具體且關(guān)鍵的問題我一直很疑惑，查了很多資料也沒找到明確答案，請各位高手幫忙解惑~ 1、陽性標(biāo)準(zhǔn)到底該如何界定？ 對結(jié)果進行陰性陽性的判定是本方法的最終目的，我查了很多相關(guān)的中英文文獻及專利，標(biāo)準(zhǔn)不一，有的認(rèn)為CT值小于40定為陽性，有的小于35，有的是37，也有的一個范圍，如CT值小于35為明確陽性，介于35至37之間為可疑陽性，需重復(fù)，也有的采用計算出來的模板拷貝數(shù)作為界線。對于這些標(biāo)準(zhǔn)到底該如何選擇，或者說是怎么建立的？有具體的方法策略嗎？ 2、關(guān)于閾值的問題 即使是確定了CT值標(biāo)準(zhǔn)，那閾值線又是如何劃定的呢？很多書上的標(biāo)準(zhǔn)說法是3-15個循環(huán)的熒光值標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，或者說可以手動調(diào)整，原則就是高于陰性對照曲線的最高點，剛進入指數(shù)期的位置。但這個具體到底該怎么操作呢？如何這么精確的定在標(biāo)準(zhǔn)差的10倍的位置啊，再說到底是算的哪些樣品的曲線前3-15個循環(huán)的熒光值啊，是所有樣品還是陰性對照樣品還是其他？手動設(shè)定方法更不靠譜了，都是肉眼看的非常主觀的調(diào)整方法，設(shè)得高一點低一點就會影響到樣品的CT值，這樣得到的陰性或陽性結(jié)果不是很不確定了嗎？另外，每批實驗閾值是否要設(shè)定完全一樣？ 3、靈敏度和線性范圍 MIQE指南里明確提到靈敏度和線性范圍是兩個不同的概念，這個我理解，一個是檢測下限，一個是標(biāo)曲中能保持線性的標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)區(qū)間。但是，這兩個值的確定具體該怎么操作呢？ 4、內(nèi)參陽性結(jié)果的評價 通常為了評估樣品本身的質(zhì)量，會同時進行內(nèi)參的擴增，只有內(nèi)參陽性的陽本待測基因的結(jié)果才有意義。但是，內(nèi)參的陽性標(biāo)準(zhǔn)又該如何界定呢？跟待測基因一樣嗎？還是要單獨建立？ 希望有高手能為小弟解答一下這些長期的疑惑，關(guān)鍵問題最好有參考文獻，不勝感激！ |
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小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 熱心積極應(yīng)助 2013-06-21 09:03:52
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問題1：一般陽性標(biāo)準(zhǔn)的判斷需要做部分實際的臨床樣品，然后做ROC曲線，確定cutoff值。 問題2：手動設(shè)定閾值和你的經(jīng)驗有很大關(guān)系，一般來說也要根據(jù)你試驗的具體情況來設(shè)定，對于定性的產(chǎn)品來說，考量的只有Ct值，所以很難去用確定的閾值定，畢竟每臺的儀器熒光信號高低都不能一樣，很難做到統(tǒng)一，做多了，你就大概能判斷出來 問題3：如果把靈敏度理解為線性范圍的檢測下限我想就可以明白了，做法嘛也簡單 問題4：內(nèi)參是為了監(jiān)控體系從提取到PCR擴增的假陰性，可以用管家基因，也可以用和你檢測無關(guān)的其它片段來做，只要起到這樣的作用就可以，所以一般來說一個完整的QPCR產(chǎn)品需要有內(nèi)參，陽性對照陰性對照等等。 |
2樓2013-06-21 08:58:01
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