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xueyutianj新蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助熒光納米顆粒標(biāo)記免疫分析實(shí)驗(yàn) 謝謝
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各位大牛好，新手求助。 最近在做一個納米顆粒偶聯(lián)的熒光二抗，納米顆粒上標(biāo)記熒光分子是FITC, 想用酶聯(lián)免疫吸附的方法驗(yàn)證這個熒光二抗的性能及檢測下限，用的是全黑的熒光酶標(biāo)板，問題是，每次做完直接用紫外燈照的話一點(diǎn)熒光都看不見，我們實(shí)驗(yàn)室也沒有能測96孔板熒光的設(shè)備，所以沒掃過熒光，只是拿紫外燈照了看，不過啥熒光也看不出來，我想拿到類似于文獻(xiàn)中的圖（見下）可不知道文獻(xiàn)里的圖是用什么設(shè)備或者什么方法做出來的，這個也許太基本了，文獻(xiàn)里也沒有詳細(xì)的這方面過程說明。求有經(jīng)驗(yàn)的指導(dǎo)。新手完全不會，實(shí)驗(yàn)室是做化學(xué)的，也完全沒這方面基礎(chǔ)。 未命名.jpg |
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myprayer
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【答案】應(yīng)助回帖
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這本書可能對樓主有用，關(guān)于熒光技術(shù)介紹的很全面，特別適合跨專業(yè)多學(xué)科交叉的新手學(xué)習(xí)，啃讀。在論壇里面能直接下載到到的 下載鏈接為 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=1923202 書名：細(xì)胞生物學(xué)熒光技術(shù)原理和應(yīng)用 作者：劉愛平 出版社：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社，2007 頁數(shù)：320頁 前言 第一部分 基本知識 第一章 光的基本知識 第二章 熒光的基本知識 第一節(jié) 熒光的發(fā)光原理 第二節(jié) 熒光色素的性質(zhì) 第三節(jié) 組織細(xì)胞的自發(fā)熒光與繼發(fā)熒光 第四節(jié) 熒光的淬滅及抗淬滅 第五節(jié) 熒光光譜交叉干擾及消除 第三章 熒光染料(色素)的早期應(yīng)用和發(fā)展史 第四章 常用的熒光染料(探針) 第一節(jié) 細(xì)胞器熒光探針 第二節(jié) 細(xì)胞骨架熒光探針 第三節(jié) 研究鈣調(diào)節(jié)及活性的熒光探針 第四節(jié) 核酸熒光探針 第五節(jié) 其他熒光探針 第五章 活體熒光材料——綠色熒光蛋白(GFP)及其衍生物 第六章 最新型熒光材料——量子點(diǎn) 第二部分 熒光色素(探針)在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用 第七章 熒光技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用 第一節(jié) 細(xì)胸凋亡及其基本通路 第二節(jié) 熒光顯微鏡對細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 第三節(jié) 凋亡調(diào)控分子的熒光標(biāo)記在細(xì)胞凋亡研究中的應(yīng)用 第四節(jié) 其他熒光技術(shù)在細(xì)胞凋亡研究中的應(yīng)用 第八章 流式細(xì)胞技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用 第一節(jié) 檢測細(xì)胞的特征 第二節(jié) 檢測細(xì)胞的增殖和凋亡狀態(tài) 第三節(jié) 定量檢測可溶性蛋白質(zhì)(CBA技術(shù)) 第四節(jié) 純化特定的細(xì)胞 第九章 熒光在細(xì)胞骨架研究中的應(yīng)用 第一節(jié) 熒光技術(shù)在微絲骨架研究中的應(yīng)用 …… 第十章 熒光原位雜交 第十一章 熒光在GER2/ErbB2/p185研究中的應(yīng)用 第十二章 綠色熒光 第十三章 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 第三部分 常用熒光檢測儀器 第十四章 生物熒光顯微鏡 第十五章 激光掃描共聚焦顯微鏡 第十六章 活細(xì)胞顯微成像技術(shù) 第十七章 活體體內(nèi)熒光成像技術(shù) 第十八章 流式細(xì)胞質(zhì)儀 第十九章 熒光定量PCR儀 第二十章 熒光分光光度計(jì) 第二十一章 激光掃描成像儀 附錄 免疫細(xì)胞化學(xué)常用試劑及其配制方法 細(xì)胞生物學(xué)熒光技術(shù)原理和應(yīng)用.png [ Last edited by myprayer on 2013-6-29 at 12:41 ] |
3樓2013-06-29 12:38:05
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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1949stone: MolEPI+1, 學(xué)習(xí)下 2013-07-01 07:52:56
kx444555: 金幣+2, 鼓勵交流 2013-06-29 23:29:24
1949stone: MolEPI+1, 學(xué)習(xí)下 2013-07-01 07:52:56
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我不是大牛，因?yàn)椴恢滥愕膶?shí)驗(yàn)?zāi)康�，所以猜不出你的二氧化硅納米小球在實(shí)驗(yàn)當(dāng)作什么用？ 我下面先解釋一下熒光量子點(diǎn)技術(shù)-----以CdSe熒光量子點(diǎn)為例和免疫膠體金技術(shù)的基本原理，以供參考。 1.熒光量子點(diǎn)技術(shù)-----以CdSe熒光量子點(diǎn)為例：任何量子點(diǎn)的核心都是有過度鈦金屬構(gòu)成，其都可以在特定波長的外界光源激發(fā)下發(fā)生熒光。CdSe是目前量子點(diǎn)最常用的化合物。下面講一下熒光量子點(diǎn)的構(gòu)成和作用原理。 （1）CdSe熒光量子點(diǎn)核心：CdSe是熒光量子點(diǎn)的核心（CdSe核心顆粒外包上ZnS層，ZnS層外包上巰基乙酸，巰基乙酸的巰基與ZnS的S形成共價(jià)鍵鏈接，巰基乙酸的羧基游離。CdSe熒光量子點(diǎn)核心就是用以激發(fā)熒光的標(biāo)記物，熒光直接有CdSe受到激發(fā)后產(chǎn)生。CdSe熒光量子點(diǎn)核心本身可以激發(fā)熒光，而且其大小不同熒光的波長也不同。 （2）CdSe熒光量子點(diǎn)核心之外的連接的功能蛋白質(zhì)： a.可分為識別細(xì)胞中的特定的生物大分子（多數(shù)為特定的蛋白質(zhì)）的抗體或者配體或者受體蛋白質(zhì)，如果說要識別的細(xì)胞內(nèi)的生物大分子是某種蛋白質(zhì)，一般的識別蛋白往往用該墓白哦蛋白質(zhì)的單克隆抗體； b.把熒光量子點(diǎn)引導(dǎo)穿過細(xì)胞膜的向?qū)У鞍踪|(zhì)，一般是細(xì)胞能夠自動內(nèi)吞的蛋白質(zhì)，比如：轉(zhuǎn)鐵蛋白，入核的話還要加上一些入核的氨基酸序列。早期的熒光量子點(diǎn)核心之外的連接的功能蛋白質(zhì)沒有把熒光量子點(diǎn)引導(dǎo)穿過細(xì)胞膜的向?qū)У鞍踪|(zhì)，那就要用顯微注射方法，將量子點(diǎn)導(dǎo)入細(xì)胞，工作量就相當(dāng)大了。 （3）CdSe熒光量子點(diǎn)核心與其核心之外的連接的功能蛋白質(zhì)之間的化學(xué)連接方式：：CdSe是熒光量子點(diǎn)的核心（CdSe核心顆粒外包上ZnS層，ZnS層外包上巰基乙酸，巰基乙酸的巰基與ZnS的S形成共價(jià)鍵鏈接，巰基乙酸的羧基游離。蛋白質(zhì)有氨基酸聚合而成，每一個蛋白質(zhì)至少有一個游離的氨基和一個游離的羧基（有修飾的情況下，一般不不會把N和C末端都修飾了，而會在中間部位修飾Lys/Arg氨基酸殘基的游離的側(cè)鏈氨基與Asp/Glu氨基酸殘基的游離的側(cè)鏈羧基。如果真的把所有的游離的氨基與羧基都修飾了，這樣的情況很少見，那么就用修飾分子的游離出活躍的基團(tuán)，比如羥基，巰基等作為連接位點(diǎn)），那么一般的蛋白質(zhì)的氨基就可以用碳二亞胺（比如： EDC）在室溫下催化講兩者的一個氨基和一個羧基脫水縮合稱為一個酰胺鍵，那么CdSe熒光量子點(diǎn)核心與其核心之外的連接的功能蛋白質(zhì)之間就通過酰胺鍵連接到一起。 （4）CdSe熒光量子點(diǎn)的作用原理：實(shí)際上進(jìn)入細(xì)胞候就是靠CdSe熒光量子點(diǎn)的單克隆抗體部分識別有關(guān)的蛋白質(zhì)------也就是此單抗的抗原，再用外界光源照射細(xì)胞，CdSe熒光量子點(diǎn)的CdSe受激輻射，就暴露了自己在細(xì)胞中的位置，同時(shí)也就暴露了其上的單抗的抗原（目的蛋白質(zhì)）的位置。觀測熒光要用熒光顯微鏡或者激光共聚焦顯微鏡，測定熒光強(qiáng)弱要用熒光光度計(jì)。 2.免疫膠體金技術(shù)：膠體金（納米金顆粒）本身可以充當(dāng)電鏡下的標(biāo)志物。 因?yàn)槟z體金顆粒能夠用電子顯微鏡直接觀察到，所以把膠體金報(bào)上有機(jī)膜之類接上抗體和內(nèi)吞蛋白質(zhì)，原理與CdSe熒光量子點(diǎn)一樣，只是顯示標(biāo)簽變成了膠體金，有時(shí)候膠體金還要與銀共同作用，以便加強(qiáng)在電子顯微鏡下的可觀測性。 我因?yàn)椴恢滥愕膶?shí)驗(yàn)?zāi)康�，所以猜不出你的二氧化硅納米小球在實(shí)驗(yàn)當(dāng)作什么用？能夠解釋你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹Ｒ驗(yàn)槟銓懙剑骸拔业募{米顆粒就是二氧化硅納米小球啊，我表面改性后接上了FITC和識別二抗，實(shí)驗(yàn)?zāi)康木褪强纯催@種接了一堆FITC的小球能不能起到熒光放大作用，提高檢測下限。”可是FITC本身就是熒光小分子，所以從激發(fā)熒光的角度講：用不著在連接到二氧化硅納米小球上，抗體的作用我能夠理解，二氧化硅納米小球的作用我不理解，因?yàn)槟憧梢灾苯影袴ITC接到抗體上，然后用顯微注射或者用再接上一段入胞的蛋白質(zhì)就可以把抗體-FITC送入細(xì)胞。二氧化硅納米小球是用于離心沉淀？還是鏈接物體？我不懂。 |
6樓2013-06-29 22:29:25
凌波麗
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xueyutianj(myprayer代發(fā)): 金幣+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-29 12:43:29
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xueyutianj(myprayer代發(fā)): 金幣+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-29 12:43:29
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不同的熒光基團(tuán)的激發(fā)波長并不相同。你是做小分子熒光標(biāo)記，還是做熒光量子點(diǎn)？你應(yīng)該不是做熒光量子點(diǎn)吧，因?yàn)闊晒饬孔狱c(diǎn)核心的過渡態(tài)盡數(shù)本身就可以激發(fā)熒光，不用再偶聯(lián)上熒光分子FITC。當(dāng)然兩者的納米顆粒（假設(shè)你的納米顆粒也是金屬顆粒）的共價(jià)鏈接的原理差不多。 樓主能不能說說你的納米顆粒是什么？是納米金嗎？你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖鞘裁矗坎蝗晃覀儧]有辦法討論下去。 |
2樓2013-06-29 00:14:43
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gyesang: 金幣+3, 鼓勵回帖應(yīng)助！ 2013-07-05 15:02:45
gyesang: 金幣+3, 鼓勵回帖應(yīng)助！ 2013-07-05 15:02:45
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我已經(jīng)查到了材料。 現(xiàn)在一般用的納米小球使用納米金或者納米銀顆粒。，其暴露于白色光源時(shí)可以在不同的波長處釋放能量，即所謂的resonance light scattering.這在蛋白質(zhì)芯片中也是一張常用的標(biāo)記手段。使用納米金或者納米銀顆粒作為標(biāo)記物，單個金或者銀的納米粒子可以相當(dāng)于500，000個熒光基團(tuán)的激發(fā)光強(qiáng)度；金或者銀的納米粒子之間不會發(fā)生漂白或者猝滅；金或者銀的納米粒子可以在激光共聚焦顯微鏡下或者普通顯微鏡暗場下直接觀測點(diǎn)到，粒子直徑一般不小于40納米，不大于80納米；金或者銀的納米粒子可以包被抗體，受體，配體或者DNA探針。 樓主用硅納米粒子也可以，但是熒光增強(qiáng)首先是納米粒子本身的作用，而不是因?yàn)榧{米粒子鏈接了眾多的熒光分子，后者最多只能線性增強(qiáng)熒光。 |
8樓2013-07-05 11:52:06
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[考研] 一志愿山大07化學(xué) 332分 四六級已過 本科山東雙非 求調(diào)劑！ +3 | 不想理你 2026-03-16 | 3/150 |
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[考研] 一志愿南昌大學(xué)，327分，材料與化工085600 +9 | Ncdx123456 2026-03-19 | 9/450 |
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[考研] 295材料求調(diào)劑，一志愿武漢理工085601專碩 +5 | Charlieyq 2026-03-19 | 5/250 |
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[考研] 086500 325 求調(diào)劑 +3 | 領(lǐng)帶小熊 2026-03-19 | 3/150 |
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[考研] 085600材料與化工調(diào)劑 324分 +10 | llllkkkhh 2026-03-18 | 12/600 |
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[考研] 收復(fù)試調(diào)劑生 +4 | 雨后秋荷 2026-03-18 | 4/200 |
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[考博] 26博士申請 +3 | 1042136743 2026-03-17 | 3/150 |
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[考研] 考研求調(diào)劑 +3 | 橘頌. 2026-03-17 | 4/200 |
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[考研] 275求調(diào)劑 +4 | 太陽花天天開心 2026-03-16 | 4/200 |
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