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hassen90銅蟲 (初入文壇)
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| 請教各位前輩關(guān)于蛋白質(zhì)方面的問題，本人以后可能要做蛋白方面的研究，現(xiàn)階段是關(guān)于純化的問題，不知道除了文獻(xiàn)以外，有沒有什么講原理和技術(shù)的書籍可以參考，經(jīng)典的和最新的都可以，還有就是研究中都可以關(guān)注些什么內(nèi)容。 |
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2樓2013-06-29 00:38:30
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小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 斑斑辛苦了 2013-06-29 13:58:21
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對于新手來說，特別是之前不是從事這方面的研究的，我結(jié)合自身的經(jīng)歷來說一下吧 找來相關(guān)研究內(nèi)容的碩士學(xué)位論文或者博士學(xué)位論文，就當(dāng)是讀教材一樣，先來科普讓自己知道大概里面有那些常用的專業(yè)術(shù)語，那些實驗技術(shù)手段，那些實驗技術(shù)手段所使用的試劑和耗材等等，這樣當(dāng)你過一段時間后，就會有個印象，再看英文文獻(xiàn)可能就會速度快很多，看起來也不是那么吃力。 看文獻(xiàn)：先看你們課題組之前的發(fā)表的文章當(dāng)然是和你以后研究方向相關(guān)的，如果有師兄師姐的話可以纏著他們，現(xiàn)在不是有句話很流行嗎‘？別怕，有師兄在，師兄幫幫忙 跑題了 這樣你就不用茫茫大海中找文章了 這個時候你也要自己看一些比較厲害的綜述類文章，什么厲害呢？就是發(fā)表的期刊比較高，被引次數(shù)也高的這種文章，能讓你清楚的知道什么熱點，什么冷門 看文獻(xiàn)怎么看論壇里面隨處能找到相關(guān)的文獻(xiàn) 此時也不要忘記看相關(guān)的教材和實驗操作，樓主最好到圖書館借一些相關(guān)的實驗教材 比較好的有 生物化學(xué)實驗原理與技術(shù) 祈元明主編 化學(xué)工業(yè)出版社 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教程 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社的 里面的實驗很詳細(xì)還有很多注意事項比如什么有毒呀，應(yīng)該采取哪些防護(hù)措施呀之類的 舉個例子加入你要做WB，這里面就會告訴你有毒，做的時候該注意哪些、？當(dāng)然任何一本書中都會提到相關(guān)的信息，這個完全看你個人喜好了 其實資源有很多，關(guān)鍵是看你怎么去索取，學(xué)生物有六個網(wǎng)站是需要關(guān)注 生物谷 丁香園 生物秀論壇 生物114 生物幫 再就是偉大的emuch牛人多多，高手如云 期待你的精彩吧 以下是一些網(wǎng)上容易找到的蛋白質(zhì)相關(guān)實驗技術(shù) 紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量 蛋白質(zhì)分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等殘基，它們的結(jié)構(gòu)中具有共軛雙鍵，對紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波長處。在此波長附近，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與其含量（范圍是0.1~1.0mg/ml）成正比，因此，280nm的吸光度可用作蛋白質(zhì)的定量測定。若將已知不同濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液在280nm處測定，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求得未知溶液的蛋白質(zhì)濃度。此法測定迅速，用量較少，而且不消耗樣品和試劑。但若樣品中含有其他在280nm吸收的物質(zhì)，如嘌呤嘧啶等化合物時，就有干擾作用。 關(guān)鍵詞：紫外吸收法蛋白質(zhì)酪氨酸色氨酸苯丙氨酸共軛雙鍵 （一）原 理 蛋白質(zhì)分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等殘基，它們的結(jié)構(gòu)中具有共軛雙鍵，對紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波長處。在此波長附近，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與其含量（范圍是0.1~1.0mg/ml）成正比，因此，280nm的吸光度可用作蛋白質(zhì)的定量測定。若將已知不同濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液在280nm處測定，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求得未知溶液的蛋白質(zhì)濃度。此法測定迅速，用量較少，而且不消耗樣品和試劑。但若樣品中含有其他在280nm吸收的物質(zhì)，如嘌呤嘧啶等化合物時，就有干擾作用。 （二）試劑及器材 （1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：準(zhǔn)確稱取經(jīng)凱氏定氮法校正的結(jié)晶牛血清白蛋白，配制成濃度為1mg/ml的溶液。 （2）待測蛋白質(zhì)溶液：濃度為1mg/ml左右的蛋白質(zhì)溶液。 （三）操作 1. 280nm的光吸收法 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取8支試管，編號后按下表加入試劑。 混勻，選用光程為1cm的石英比色杯，在紫外分光光度計280nm波長處以0號管調(diào)“零”分別測定各管溶液的光密度（OD280）。以縱坐標(biāo)為光密度值，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)濃度繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （2）樣品測定：取待測蛋白質(zhì)溶液1ml，加入蒸餾水3ml，混勻，按上述方法測定280nm波長處的光密度值，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測蛋白質(zhì)的濃度。 2．280nm和260nm的吸收差法將待測的蛋白質(zhì)溶液稀釋到光密度在0.2~2.0之間，在波長280nm和260nm處以相應(yīng)的溶液作空白對照，分別測得待測樣品的光密度值（OD280和OD260）。應(yīng)用280nm和260nm的吸收差法經(jīng)驗公式直接計算出蛋白質(zhì)濃度。 公式： 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45 OD280—0.74 OD260 [ Last edited by myprayer on 2013-6-29 at 13:35 ] |
3樓2013-06-29 13:10:47
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3 DEAE—離子交換劑純化血清IgG 離子交換是指液相中的離子與固定相上可解離基團的可逆交換反應(yīng)。利用這個反應(yīng)先將要分離的混合物在一定pH的溶液中解離，而后流經(jīng)固定相，使之與固定相上的可解離基團進(jìn)行離子交換，吸附于固定相上，凡不能進(jìn)行交換吸附的成分，則流出層析柱外。再根據(jù)交換吸附于固定相上的各組分解離度的差別，運用不同的pH值或不同鹽濃度的溶液作流動相，流過層析柱將各組分分別再交換洗脫下來，這樣混合物的各組分即被分開，達(dá)到分離的目的，此即為離子交換層析。 關(guān)鍵詞：離子交換血清DEAE離子交換劑血清IgG （一）原理 離子交換是指液相中的離子與固定相上可解離基團的可逆交換反應(yīng)。利用這個反應(yīng)先將要分離的混合物在一定pH的溶液中解離，而后流經(jīng)固定相，使之與固定相上的可解離基團進(jìn)行離子交換，吸附于固定相上，凡不能進(jìn)行交換吸附的成分，則流出層析柱外。再根據(jù)交換吸附于固定相上的各組分解離度的差別，運用不同的pH值或不同鹽濃度的溶液作流動相，流過層析柱將各組分分別再交換洗脫下來，這樣混合物的各組分即被分開，達(dá)到分離的目的，此即為離子交換層析。 離子交換層析中的固定相稱為離子交換劑。它是由在不溶性高分子母體上引入不同的可解離基團所構(gòu)成。常用的不溶性高分子母體有纖維素、葡聚糖、瓊脂糖及人工合成的樹脂等。引入于母體上的活性基團主要有酸性或堿性物質(zhì)。由于引入的酸性物質(zhì)可解離出H+離子，能與液相中的陽離子交換，故這類離子交換劑稱為陽離子交換劑；引入的堿性物質(zhì)可解離出OH－離子，能與液相中的陰離子交換，故將這類離子交換劑稱為陰離子交換劑。 由于引入的酸或堿的強弱不同，兩類離子交換劑又分為不同的型。 酸類物質(zhì)以磺酸基（－SO3H）最強，引入磺酸基的陽離子交換劑稱為強酸型；引入磷酸基（－PO3H2）、亞磷酸基（－PO2H）的稱中強酸型；引入羧基（－COOH）、酚羥基（－OH）的稱為弱酸型。 堿類物質(zhì)主要是引入胺堿。引入季胺[ ―N+（CH3）3OH― ]基的稱為強堿型；引入叔胺[－N（CH3）2 ]、仲胺（－NHCH3）、伯胺（－NH2）基的稱為弱堿型。 各型離子交換劑國內(nèi)外都已定型生產(chǎn)，性能和規(guī)格均可查到，本書附錄四中列舉了一部分。 各型離子交換劑的使用，將由用以分離的物質(zhì)特性及分離的目的而定。 分離蛋白質(zhì)（包括酶）常用纖維離子交換劑。由于蛋白質(zhì)（酶）的分子量很大，在交換反應(yīng)后要占有離子交換劑很大的空間位置，不溶性母體空間位置小的交換劑將無法與蛋白質(zhì)交換容量很低。纖維素作為不溶性母體是因為纖維素具有親水性強，容易溶脹；溶脹后具有舒展的長鏈，表面積大，使大分子特質(zhì)容易接觸并容納。所以，以纖維素形成的離子交換劑對蛋白質(zhì)（酶）等大分子物質(zhì)的交換容量大，分辨力強，可以獲得較好的分離效果及較高的因收率；另外纖維構(gòu)成的離子交換劑對交換的離子吸附力較弱，用比較溫和條件即可洗脫下來，不影響蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)的活性。纖維素的這些特點使它構(gòu)成的纖維素離子交換劑在生物大分子的分離和純化中得到廣泛的使用。 纖維素上可以引入不同的解離基團而形成各型離子交換劑，其中最常用的是DEAE纖維素和羧甲基纖維素。 DEAE—纖維素（diethylaminoethyl—cellulose，DEAE）是在纖維素上引入二乙基氨基乙基， 它是弱堿型陰離交換劑。吸附蛋白質(zhì)的最適pH范圍為7～9，pH超過9.5，DEAE基團則不解離帶電荷。每克DEAE含0.96～1.24mmol/L可解離基團，與蛋白質(zhì)的交換量可達(dá)75～122mg/100mgDEAE。 交換吸附于離子交換劑上的物質(zhì)，通常利用改變洗脫液pH或提高洗脫液中離子強度的方法洗脫下來，從而獲得較純的特質(zhì)。當(dāng)在離子交換劑上吸附有幾個物質(zhì)成分時，可用兩種方法分別洗脫下來。其一是用pH或離子強度不同的幾種洗脫液分別洗脫，即在第1種洗脫液洗脫下第1個成分后，換成第2種洗脫另一成分，再換第3種洗脫液脫下第3個成分，如此洗脫下所有的成分，這種方法稱為分段洗脫法。其二是在洗脫的過程中逐步改變洗脫液的離子強度，從稀到濃，逐步將各種成分洗脫下來，這種方法稱為梯度洗脫法。與分段洗脫法相比，梯度法使被洗脫成分的“拖尾”現(xiàn)象較小，分辨率高。 應(yīng)用離子交換劑來純化物質(zhì)，可以是把要純化的物質(zhì)成分交換吸附于離子交換劑上，然后再分別洗脫下來獲得純品，或者把不需要的成分吸附于離子交換劑上，需要的成分直接流出，得到純品。本實驗采用DEAE-纖維素層析柱純化血清IgG，利用pH6.7的緩沖液溶解樣品IgG，此時IgG粗物中除IgG外，其他雜蛋白均帶上不同數(shù)量的負(fù)電荷，可以和DEAE上的陰離子發(fā)生交換吸附于柱上。IgG因不解離帶電，而不發(fā)生交換吸附，利用此特點，讓溶解后的樣品流過DEAE纖維素柱，即可直接收集到較純的IgG （二）試劑及器材 （1）DEAE—纖維素的活化：稱取IgDEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸餾水浸泡過夜，觀察溶脹后DEAE的體積。根據(jù)所需層析柱的柱床體積計算所需DEAE的用量，稱取所需DEAE用蒸餾水浸泡過夜，其間換幾次水，每次除去細(xì)小顆粒。抽干，改用0.5ml/LNaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用無離子水漂洗，使pH至8左右（用pH試紙檢查）。再改用0.5ml/LHCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用無離子水洗至pH6左右。本實驗中在用前應(yīng)以0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，浸泡平衡后使用。 用過的離子交換劑可以反復(fù)使用，使其恢復(fù)原狀的方法俗稱“再生”。再生并非每次用酸、堿反復(fù)處理，通常只要“轉(zhuǎn)型”處理即可。所謂轉(zhuǎn)型就是使交換劑帶上所希望的某種離子，如希望陽離子交換劑帶上NH+4則可用NH4OH浸泡，如希望陰離子交換劑帶上Cl—則用NaCl溶液處理。本實驗中DEAE—纖維素在酸堿處理后，用0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖溶液浸泡即可轉(zhuǎn)型，以HPO4取代DEAE中的OH—。一般由于DEAE—纖維素使用后因帶有大量雜蛋白，所以再生時，先用0.5ml/L NaOH浸洗，用無離子洗至pH8左右，再轉(zhuǎn)型，即可再使用。 （2）0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸鹽緩沖溶液 （3）奈氏試劑。 （4）20%（W/V）磺基水楊酸溶液。 （5）1cm×50cm （6）黑、白比色磁盤。 （三）操作 1．裝柱 用0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸鹽緩沖溶液浸泡已處理好的DEAE—纖維素，并更換1～2次。然后攪拌均勻，灌入層析柱中，直至纖維素柱床高約17cm左右為止。柱床形成后，在洗脫瓶裝入0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸鹽緩沖溶液，接在層析柱上口，打開柱下端出口，使磷酸鹽緩沖溶液流過纖維素，直至流出液的pH值與磷酸鹽緩沖溶液的pH值完全相同（用pH試紙不斷檢查）為止。 2．上樣 上述平衡過程完畢后，關(guān)閉柱下口。用滴管吸去纖維素柱面上的深液（但不能低于柱下口，控制流速使樣品慢慢進(jìn)入纖維素內(nèi)。待全部樣品進(jìn)入柱后，在柱床面上加一層0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸鹽緩沖溶液。 3．洗脫 連接洗脫瓶，打開柱下口開始洗脫。控制流速為0.5ml/min, 用試管收集洗脫液，每管10滴。從每滴中取1滴收集液放入在黑色比色盤孔中，加入1滴20%磺基水楊酸檢查是否產(chǎn)生白色沉淀。在此條件下在收集液中首先出現(xiàn)的蛋白質(zhì)即為純化的IgG。因此，從洗脫開始就應(yīng)收集洗脫液，直至收集液中無蛋白質(zhì)出現(xiàn)為止（加磺酰水楊酸不呈白色沉淀），合并含有蛋白質(zhì)的各管收集液中無蛋白質(zhì)即為純化的IgG溶液。 柱內(nèi)DEAE—纖維素經(jīng)再生轉(zhuǎn)型后可再用。 4．鑒定 純化后獲得的蛋白質(zhì)樣品均應(yīng)進(jìn)行鑒定后方能證明產(chǎn)品的合格證。 以上實驗來自生物秀相關(guān)論壇。 |
4樓2013-06-29 13:13:08
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4 凝膠層析法脫鹽和分離蛋白質(zhì)（附凝膠過濾法原理及基本操作） 凡鹽析所獲得的粗制蛋白質(zhì)（鹽析得到的IgG）中均含有硫酸銨等鹽類，這類將影響以后的純化，所以純化前均應(yīng)除去，此過程稱為“脫鹽”（desalthing）。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法，這兩種方法各有利弊。前者的優(yōu)點是透析后析品終體積較小，但所需時間較長，且鹽不易除盡；凝膠過濾法則能將鹽除盡，所需時間也短，但其凝膠過濾后樣品體積較大。所以，要根據(jù)具體情況選擇使用。前實驗中樣品體積較小，凝膠達(dá)濾后樣品體積不會太增加，所以選用凝膠過濾法。 關(guān)鍵詞：凝膠層析脫鹽凝膠層析法分離蛋白質(zhì)凝膠過濾法desalthing （一）原理 凡鹽析所獲得的粗制蛋白質(zhì)（鹽析得到的IgG）中均含有硫酸銨等鹽類，這類將影響以后的純化，所以純化前均應(yīng)除去，此過程稱為“脫鹽”（desalthing）。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法，這兩種方法各有利弊。前者的優(yōu)點是透析后析品終體積較小，但所需時間較長，且鹽不易除盡；凝膠過濾法則能將鹽除盡，所需時間也短，但其凝膠過濾后樣品體積較大。所以，要根據(jù)具體情況選擇使用。前實驗中樣品體積較小，凝膠達(dá)濾后樣品體積不會太增加，所以選用凝膠過濾法。 （二）試劑與器材 （1）Sephadex G-25。 （2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液。 （3）奈氏（Nessler）試劑：于500ml錐形瓶內(nèi)加入碘化鉀150g，碘110g，汞150g及蒸餾水100ml。用力振蕩7～15min，至碘的棕色開始轉(zhuǎn)變時，混合液溫度升高，將此瓶浸于冷水內(nèi)繼續(xù)振蕩，直到棕色的碘轉(zhuǎn)變?yōu)閹ЬG色的碘化鉀汞液為止。將上清液傾入2000ml量筒內(nèi)，加蒸餾水至2000ml，混勻備用。 （4）20%（W/V）磺基水楊酸溶液。 （5）1.5cm×20cm層析柱。 （6）黑、白比色磁盤。 （三）操作 （1）取層析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，關(guān)閉下端出口。將已經(jīng)溶脹好的Sephadex G-25中的水傾倒出去，加入2倍體積的0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并攪拌成懸浮液，然后灌注入柱，打開柱的下端出口，繼續(xù)加入攪勻的Sephadex G-25，使凝膠自然沉降高度到17cm左右，關(guān)閉出口。待凝膠柱形成后，在洗脫瓶中加入0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液以3倍柱體積的磷酸鹽緩沖流過凝膠柱，以平衡凝膠。 （2）凝膠平衡后，用皮頭滴管除去凝膠柱面的溶液，將鹽析所得全部IgG樣品加到凝膠柱表面，打開柱下口，控制流速讓IgG樣品溶液慢慢浸入凝膠內(nèi)。凝膠柱面上加一層的0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并用此緩沖液洗脫，控制流速為0.5ml/min左右。用試管收集洗脫液，每管10滴。 （3）在開始收集洗脫液的同時檢查蛋白質(zhì)是否已開始流出。為此，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盤中，加入1滴20%磺基水楊酸，若呈現(xiàn)白色絮狀沉淀即證明已有蛋白質(zhì)出現(xiàn)，直到檢查不出白色沉淀時，停止收集洗脫液。 （4）由經(jīng)檢查含有蛋白質(zhì)的每管中，取1滴溶液，放置在白色比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑，若呈現(xiàn)棕黃色沉淀說明它含有硫酸銨。合并檢查后不含硫酸銨的各管收集液，即為“脫鹽”后的IgG。 注意：在檢測時，用皮頭滴管吸取管中溶液后應(yīng)及時洗凈，再吸取下一管，以免造成相互污染假象。 附：凝膠過濾法原理及基本操作 1．原理 凝膠過濾（gel filtration），又稱為凝膠層析（gel chromatography）、分子篩過濾（molecularsieve filtration）、凝膠滲透層析（gel osmotic chromatography）等。它是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一種層析技術(shù)。其基本原理是利用被分離物質(zhì)分子大小不同及固定相（凝膠）具有分子篩的特點，將被分離物質(zhì)各成分按分子大小分開，達(dá)到分離的方法。 凝膠是由膠體粒子構(gòu)成的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。網(wǎng)眼里吸滿水后凝膠膨脹呈柔軟而富于彈性的半固體狀態(tài)。人工合成的凝膠網(wǎng)眼較均勻地分布在凝膠顆粒上有如篩眼，小于篩眼的物質(zhì)分子均可通過，大于篩眼的物質(zhì)分子則不能，故稱為“分子篩”。凝膠之所以能將不同分子的物質(zhì)分開是因為當(dāng)被分離物質(zhì)的各成分通過凝膠時，小于篩眼的分子將完全滲入凝膠網(wǎng)眼，并隨著流動相的移動沿凝膠網(wǎng)眼孔道移動，從一個顆粒的網(wǎng)眼流出，又進(jìn)入另一顆粒的網(wǎng)眼，如此連續(xù)下去，直到流過整個凝膠柱為止，因而流程長、阻力大、流速慢；大于篩眼的分子則完全被篩眼排阻而不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)眼，只能隨流動相沿凝膠顆粒的間隙流動，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出層析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能進(jìn)入或完全滲入凝膠篩眼之間的物質(zhì)分子，則居中流出。這樣被分離物質(zhì)即被按分子的大小分開。 用于凝膠層析的凝膠均為人工合成的產(chǎn)品，主要有交聯(lián)葡聚糖（商品名為Sephadex）、瓊脂糖（商品名為Sepharose）、聚丙烯酰胺凝膠（商品名為Bio–gel）及具有一定網(wǎng)眼的細(xì)玻璃珠等和這些凝膠的衍生物。 下面主要介紹葡聚糖凝膠，這是由葡萄糖的多聚物與1–氯– 2、3–環(huán)氧丙烷交連而成。環(huán)氧丙烷引入丙三醇基將鏈狀的多聚葡萄糖單位交聯(lián)起來，凝膠網(wǎng)眼的大小由多聚葡萄糖的分子和環(huán)氧丙烷的比例（交聯(lián)度）來控制。 葡聚糖具有較強的親水性，在水和電解質(zhì)溶液中膨脹成為柔軟而富于彈性的凝膠，其吸水能力與葡聚糖凝膠的交聯(lián)度有密切關(guān)系。交聯(lián)度大的，孔徑小，吸水少，膨脹的程度��；交聯(lián)度小的，孔徑大，吸水多，膨脹的程度大。因此，葡聚糖凝膠孔徑的大小可以其吸水量的大小來表示，常以G–10至G–200號碼標(biāo)記。G后面的數(shù)字是其吸水量（毫升水/克干膠）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量為2.5ml/2干膠。市售有G–10、G–5、G–50、G–75、G–100、G–150、G–200等型號。G–75以上的膠因吸水量大，膨脹后形態(tài)柔軟易變，統(tǒng)稱為軟膠。G–75以下的稱為硬膠。 葡聚糖凝膠可分離的分子大小從幾百到數(shù)十萬�？筛鶕�(jù)被分離物質(zhì)的分子大小及目的選擇使用。一般說Sephadex G–l0～15通常用于分離肽及“脫鹽”。Sephadex G–75～200用以分離各類蛋白質(zhì)。 凝膠層析是一種物理分離法。葡聚糖凝膠基本上不帶電荷呈多惰性，不與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，所以分離的效果較好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羥基，能吸附少量蛋白質(zhì)等被分離的物質(zhì)。為了克服這個缺點，一般使用含有離子強度達(dá)0.08的NaCl等中性鹽緩沖液作洗脫液。 2．操作 （1）凝膠溶脹（水化）商品葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠均為干燥顆粒。使用前必須水化溶脹。商品瓊脂糖凝膠呈懸浮膠體可直接用，玻璃球不用溶脹。 凝膠溶脹有兩種方法：一種是將所需葡聚糖凝膠浸入蒸餾水中于室溫下溶脹；另一種是置于沸水浴中溶脹。各種葡聚糖在上述溶脹方法中所需的時間見下表： 型號 溶脹時間（小時）20~25℃ 分離范圍（蛋白質(zhì)，Mr） G-10 3 至700 G-15 3 至1500 G-25 3 1000~1500 G-50 3 1500~3000 G-75 24 3000~7000 必須浸泡足夠的時間以使凝膠充分溶脹。兩種方法中，沸水浴溶脹不但節(jié)省時間，還可以殺滅凝膠中污染的細(xì)菌并排出網(wǎng)眼中氣體。 凝膠溶脹后，需用蒸餾水洗滌幾次，每次應(yīng)將沉降緩慢的細(xì)小顆粒隨水傾倒出去，以免在裝柱后產(chǎn)生阻塞現(xiàn)象，降低流速。洗后將凝膠浸泡在洗脫液中待用。 一支層析柱中應(yīng)該裝入的干膠量可以用下法推算：稱取1g所需型號的葡聚糖干膠，放在5ml量筒中，用室溫溶脹的方法充分溶脹，觀察溶脹后凝膠的體積。然后在層析柱中加水到所需柱床高度，將水倒出，量取柱床體積。根據(jù)1g干膠溶脹后的體積和所需柱床體積，即可推算出干膠的需要量。 （2）裝柱將層析劑裝入柱中進(jìn)行層析的方法稱柱層析法。作層析用的柱子稱層析柱。層析柱有玻璃和透明塑料的兩種。柱子的一端為進(jìn)口，另一端為出口，出口端底部有燒結(jié)玻璃砂板或尼龍布，能阻止層析劑流出，溶劑則可流過。如果沒有市售的層析柱，可以選用粗細(xì)均勻，長短合適的玻璃管，在兩端塞上合適的膠塞，膠塞中插人細(xì)玻璃管，在一端放一層尼龍布為出口，即可作為層析柱使用。層析柱的長短粗細(xì)根據(jù)實驗的目的而定，一般說來，凝膠層析時柱越長，分離效果越好。但柱過長，層析時間長，樣品易稀釋造成擴散，反而影響分離效果。柱的內(nèi)徑不宜較細(xì)，直徑1cm以下的柱易發(fā)生“管壁效應(yīng)”，即柱中部分的物質(zhì)組分移動較快，管壁周圍的則移動較慢，造成分離混亂。當(dāng)然柱的內(nèi)徑也不宜過粗。 凝膠層析中，在把小分子物質(zhì)（mw<1 500），如無機或其他物質(zhì)與大分子物質(zhì) （mw<20 000）分離時，層析柱的體積一般約為樣品的4–10倍，高度與直徑的比例為5：1至15：1之間。這類柱也稱為“脫鹽”柱，常用網(wǎng)孔很小的凝膠如G–25。用以將生物大分子物質(zhì)彼此分開的分級層析柱，體積應(yīng)為樣品體積的25～100倍。柱長度與直徑的比例為20：1～100：1。 裝柱的操作過程如下：將層析柱垂直固定在支架上，打開柱下口開關(guān)。將溶脹好的凝膠放在燒杯中，使凝膠表面上的水層與凝膠體積相等。用玻璃棒攪勻凝膠液，順玻璃棒灌入柱內(nèi)。此時柱下口一邊排水，上口一邊加入攪勻的凝膠，可見凝膠連續(xù)均勻地沉降，逐步形成凝膠柱。當(dāng)?shù)竭_(dá)所需凝膠柱高度時，立即關(guān)閉下口，待凝膠自然沉降形成凝膠柱床。凝膠柱床一般應(yīng)離柱頂3~5cm，并覆蓋一層溶液。 灌注凝膠時要求將均勻的凝膠一直加到所需柱床高度，不能時斷時續(xù)，否則將出現(xiàn)分層或“紋路”等毛病。若中途出現(xiàn)這些現(xiàn)象，可以用玻璃棒將已形成的柱床逐步攪起，直至出毛病的部分再讓凝膠重新沉降或繼續(xù)加入攪勻的凝膠懸液。若在灌好膠后才發(fā)現(xiàn)“紋路”、分層等現(xiàn)象時，要重新裝柱，以免影響層析效果。在做大型的凝膠柱時，灌注的凝膠是否均勻往往從表面上看不出來。所以使用前應(yīng)該用一些帶色的大分子物質(zhì)如細(xì)胞色素C、血紅蛋白或?qū)Ｓ玫乃{(lán)色葡聚糖–2 000 （Blue dextran–2 000）通過凝膠柱，觀察形成的色斑帶是否整齊，若斑帶歪斜，應(yīng)該重新裝柱，直至達(dá)到要求。 剛從冰箱中取出的凝膠液，不能馬上用來灌柱，應(yīng)平衡至室溫后再用，不然裝好的凝膠會產(chǎn)生大量的氣泡影響層析。 在整個灌注凝膠的過程及使用中，凝膠柱面上一定要覆蓋著一層溶液，以免進(jìn)入空氣。若進(jìn)空氣再加入溶液時，凝膠柱中易形成氣泡。 （3）平衡裝好的凝膠柱，使用前應(yīng)該用相當(dāng)于柱床體積兩倍或更多的洗脫液流過凝膠柱，以壓實凝膠，稱為平衡。 （4）上樣將樣品加入到凝膠柱中，準(zhǔn)備層析的過程稱上樣。上樣時，應(yīng)該注意上樣量的多少、樣品的黏稠度及離子強度。這三個因素會影響到以后層析的效果。一般來說“脫鹽”層析時，上樣體積可為柱體積的10%～25%；生物大分子的分級分離，約為柱體積的1%～5%。樣品的黏稠度一般不宜大于洗脫液黏稠度的2倍以上，不然洗脫峰會變寬和歪斜。離子強度要達(dá)到0.08，以免產(chǎn)生特異性吸附。 上樣操作：先打開層析柱的下口開關(guān)，放出凝膠柱面上的溶液，或用皮頭吸管吸取，使液面與凝膠表面相平齊，但切忌液面低于凝膠表面。然后將樣品加在凝膠表面，打開柱下口開關(guān)，控制流速，使樣品慢慢滲入凝膠內(nèi)。加樣時注意勿將凝膠柱面沖起形成凹面，也不能沿管壁流下，以免樣品沿柱壁與凝膠柱的間凝膠隙漏下。當(dāng)慢慢滲入凝膠的樣品液液面與凝膠柱面相平時，關(guān)閉下口，完成上樣。然后在凝膠柱面上加一層（3～5cm）洗脫液，接上洗脫瓶準(zhǔn)備洗脫。 （5）洗脫用規(guī)定的溶液流過樣品，使分子量不同的樣品逐步分開并先后由柱床流出的過程稱為洗脫。所用溶液稱洗脫液。洗脫液放在貯液瓶（洗脫瓶）中并與層析柱相通連。洗脫時只要打開層析柱下口開關(guān)，洗脫液即可流出。 洗脫過程中保持恒定的流速是柱層析獲得良好分離效果的重要條件。因為凝膠層析的分離作用主要取決于分子擴散進(jìn)入凝膠的機會，流速過快有些分子來不及在分子篩中分配而流出；過慢時已分離的分子會因擴散而混合。因而要保持適當(dāng)?shù)暮愣魉�。洗脫液的流速取決于它的靜水壓。靜水壓是指洗脫瓶中洗脫液的液面高出于層析柱出口產(chǎn)生的液體壓力（或接觸空氣的兩個液面間的高差），這個高度差越大，靜水壓越大，洗脫液的流速就越快。這個壓力差可以調(diào)動，如提高洗脫瓶的位置或瓶中液面的增減；或者降低或提高層析柱出口的位置等，因此靜水壓又稱操作壓。 由于靜水壓越大，洗脫液的流速就越快。在固定洗脫瓶與出口位置的情況下，靜水壓會在洗脫過程中，隨著洗脫瓶中溶液減少液面不斷下降而減少，難以維持流速的恒定。為了解決這個問題，Marriotte首次將洗脫瓶加塞塞緊，塞中插入玻璃管，使玻管下口深入到洗脫液的底部，這樣洗脫液的靜水壓便等于此玻管下口的液面高出層析柱出口液面的高度（因為當(dāng)洗脫瓶液體流出時，瓶頂形成真空，空氣只從玻璃管中進(jìn)入，玻管下口即為接觸空氣點），因此只要溶液不低于玻璃管下口，玻璃管口以上溶液的增減將不影響靜水壓，從而自動保持了流速的恒定，此洗脫瓶稱為恒壓瓶，也叫馬氏瓶。當(dāng)然，當(dāng)洗脫液減少至液面低于玻管的下口時，便會失去作用，但這時可用及時加入洗脫液來解決。 在凝膠層析中，不僅要保持靜水壓的恒定，還要保持適當(dāng)?shù)撵o水壓。這是因為G–75以上的軟膠膠體柔軟易變形，對靜水壓僅有一定的承受能力，不同軟膠的承受能力也不相同，靜水壓超過凝膠的承受能力時，最初流速會很快；其后隨著靜水壓力過大將使軟膠變形壓緊，流速逐漸降低，最后甚至流不出。所以，保持恒定正確的靜水壓是凝膠層析時獲得滿意結(jié)果的必要條件。 脫鹽一般使用的是G–25屬于硬膠，硬膠不易變形，受靜水壓的影響較小，實驗過程中的流速可用恒壓瓶下口橡皮管上的螺旋夾控制在0.5ml/min左右，隨著洗脫液的流出，樣品逐步被分開。用試管收集洗脫液，按順序每管收集2ml。 （6）檢測 在收集的同時，檢查蛋白質(zhì)是否流出。于每管中取出1滴放在黑色比色板孔中（按編號順序），再分別加入1滴20%磺酰水揚酸，如出現(xiàn)白色沉淀即表示蛋白質(zhì)已流出凝膠柱，如此一直檢查到蛋白質(zhì)全流出為止。與此同時，再從蛋白質(zhì)的管中取出1滴于白色比板中，加入奈氏試劑1滴，如蛋白管中不出現(xiàn)棕色，即表示蛋白質(zhì)中的硫酸銨已除去。合并純化后的蛋白質(zhì)管以待用。以光密度值為縱坐標(biāo)，以收集管的順序號為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪圖�？色@具有一條洗脫峰的曲線，稱為洗脫曲線，用以表示被分離物質(zhì)流出的狀態(tài)。 （7）凝膠的洗滌及保存由于凝膠對被分離的物質(zhì)基本無吸附作用，所以無需“再生”，只要用洗脫液沖洗后即可連續(xù)使用。但因多次使用凝膠顆粒將逐漸沉積壓緊，流速將減慢，所以使用一段時間后應(yīng)倒出來，清洗后重新裝柱。 凝膠暫時不使用可浸泡在溶液中，存放在4℃冰箱中。若放在室溫保存應(yīng)加入0.02%疊氮鈉（NaN3）或0.01%乙酸汞等防腐劑，以防發(fā)霉。用時以水洗去防腐劑即可使用。凝膠長期不用，可用水洗凈，分次加入百分濃度遞增的乙醇溶液，每次停留一段時間，使之平衡，再換一下濃度的乙醇，讓凝膠逐步脫水，再用乙醚除乙醇，抽干即可，或?qū)⒛z洗凈后抽干，在表面皿上30℃逐步烘干。 |
5樓2013-06-29 13:14:50
myprayer
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5 GST-融合蛋白（GST fusion protein purification）的表達(dá)與純化 2010-08-12 18:12:53來源：易生物實驗 瀏覽次數(shù)：1634網(wǎng)友評論 0 條 GST純化系統(tǒng)是利用GST （glutathione-S-transferase ）融合蛋白與固定的谷胱甘肽（GSH）通過硫鍵共價親和，通過GSH交換洗脫的原理來進(jìn)行純化 。1ml樹脂大約可結(jié)合5-8 mg融合蛋白，并可反復(fù)使用數(shù)次。試劑u IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷） 2g IPTG 溶解入10ml 水，過濾除菌，分裝，-20℃保存。 關(guān)鍵詞：蛋白GST-融合蛋白GSTfusionproteinpurificationGST純化系統(tǒng) 原理 GST 純化系統(tǒng)是利用GST （glutathione-S-transferase ）融合蛋白與固定的谷胱甘肽（GSH）通過硫鍵共價親和，通過GSH交換洗脫的原理來進(jìn)行純化 。1ml樹脂大約可結(jié)合5-8 mg融合蛋白，并可反復(fù)使用數(shù)次。試劑u IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷） 2g IPTG 溶解入10ml 水，過濾除菌，分裝，-20℃保存。u Lysis buffer （50ml）1)2.5ml 1 M Tris，pH8.0 2)0.1ml 0.5ml EDTA 3)0.292g NaCl4)0.5ml Triton X-100 5)0.25ml 1M DTT u Elution buffer 1)0.615g glutathione 2)10 ml 1M Tris，pH8.0 3)90ml distilled water . 操作步驟 1)挑一個克隆至2ml LB液中（Amp+ ） 2)37℃振搖至OD600值約為0.6 3)將2ml菌液加入100 ml LB中 4)37℃振搖至OD600值約為0.6 5)加入IPTG至終濃度為1mM 6)繼續(xù)搖3～4h 7)離心（5000 rpm，5min，4℃） 8)用10×柱體積的lysis buffer懸浮細(xì)菌 9)超聲破碎細(xì)胞 10)離心（12,000rpm,15min,4℃），取上清 11)用濾紙過濾 12)加0.5 ml 50%谷胱甘肽瓊脂糖beads于層析柱 13)5×柱體積的lysis buffer洗層析柱 14)樣品過柱 15)5×柱體積的lysis buffer洗層析柱 16)3×柱體積的elution buffer洗脫蛋白 17)收集蛋白：0.5ml/管 18)取20ml樣品SDS-PAGE鑒定可以在buffer里增加點蛋白酶抑制劑，防止蛋白的降解。 |
6樓2013-06-29 13:16:02
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簡木ChuFront 2026-03-19 | 8/400 |
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[考研] 一志愿 南京航空航天大學(xué)大學(xué) ，080500材料科學(xué)與工程學(xué)碩 +5 | @taotao 2026-03-20 | 5/250 |
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[考研] 一志愿中國海洋大學(xué)，生物學(xué)，301分，求調(diào)劑 +5 | 1孫悟空 2026-03-17 | 6/300 |
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