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jannver

鐵蟲 (小有名氣)

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專業(yè): 消化與呼吸系統(tǒng)藥物藥理

[求助] 請(qǐng)教DNA電泳問題，使用SYBR Green I 染色

請(qǐng)教DNA電泳問題，使用SYBR Green I 染色

我的操作簡(jiǎn)述如下：

1、2%低熔點(diǎn)瓊脂糖100ml，加熱后放涼到60度時(shí)，加入SYBR Green I 原液10ul，混勻后制膠。

2、將樣品和loading buffer 按常規(guī)比例體積混合，10min后上樣。

3、上樣體積10ul，我的樣品濃度約在200 nM。

4、電泳條件：70V（7V/cm），0.5 TBE Buffer，冰水浴電泳，3h。

5、我設(shè)了兩個(gè)Ladder，一個(gè)范圍是49kb~0.8kb，另一個(gè)范圍是500bp~25bp。

這個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)了兩層，結(jié)果類似，都好像有問題：

1、在電泳開始不久就發(fā)現(xiàn)樣品條帶有黃綠色帶條出現(xiàn)，電泳結(jié)束是黃綠色帶條變的很粗（信號(hào)強(qiáng)）。

2、目的條帶和Ladder情況：

（1）M1 范圍是49kb~0.8kb的Ladder 沒有分離開，只出現(xiàn)3條帶。
（2）M2范圍是500bp~25bp的Ladder 有分開，但信號(hào)很弱（可能是我的上樣濃度小了）。
（3）我的目的條帶都應(yīng)該在23kb附近，但是電泳結(jié)果信號(hào)都處于50bp，而且條帶間橫向沒有分開，全連在一起了。
（4）我的目的條帶理論上應(yīng)該有梯帶出現(xiàn)，但是沒有出現(xiàn)。

說明：我的實(shí)驗(yàn)是用若干條序列彼此部分互補(bǔ)的50bp的單鏈DNA作為原料，通過緩慢淬火，使之形成DNA納米結(jié)構(gòu)，目標(biāo)產(chǎn)物大小應(yīng)該在23kb。

我的疑問是：

1、我的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是不是有問題，根本沒有形成納米結(jié)構(gòu)，所以電泳結(jié)果條帶仍然是50bp，與原料很近。

2、是不是SYBR Green I 制膠的方法有誤，不應(yīng)該將SYBR Green I 直接加到膠里，而應(yīng)該和樣品預(yù)混后再上樣才好。

3、是不是我的上樣體積或樣品濃度太大?

謝謝，希望得到高手指教。

20130628_2208.jpg

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不懈怠，不放棄

1樓 2013-06-28 23:42:10

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智能機(jī)器人

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