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[求助]
western blotting 顯影曝光結(jié)果不理想，求高手指點(diǎn)
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最近做western blotting每次到最后顯影曝光結(jié)果都不是很理想，蛋白樣品量有限，屬于小分子蛋白22kd，抗體由國產(chǎn)換為進(jìn)口抗體，ECL為Pierce的，顯影液和定影液為博士德的。 求高手指點(diǎn)如何在蛋白濃度較低的樣品中把WB做好？ 顯影定影曝光方面為手動暗室曝光，有什么好的實(shí)驗(yàn)技巧，求分享，謝謝！ 也可以推介一下好的顯影液和定影液， |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
aksand: 金幣+15, ★★★很有幫助 2013-07-02 14:37:29
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aksand: 金幣+15, ★★★很有幫助 2013-07-02 14:37:29
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相信你多做幾遍效果就出來了。我之前也是一直掌握不好上樣量以及曝光時(shí)間，做了近2周終于做出比較漂亮的條帶了。我個(gè)人總結(jié)主要有下面幾點(diǎn)： 1、蛋白的提取很重要，超聲破碎度要掌握好，當(dāng)然我是用來做CoIP的，超聲破包時(shí)不能太過，否則影響蛋白之間的互作。如果只是提取總蛋白，可以盡量徹底超聲破碎，這樣提取的目的蛋白濃度會高一些。 2、上樣量，如果蛋白豐度較低，可以加大上樣量，1.0mm的膠不行就換1.5mm的，這樣每個(gè)上樣孔可以加到40-50ul。 3、一抗時(shí)間：如果蛋白豐度低，可以延長雜交時(shí)間，過夜也行。 4、洗滌：洗滌非常關(guān)鍵，如果洗不好，背景特別高。我一般是先用5ml的槍吸取PBST沖洗3遍，再加入較多的PBST快速洗2min，然后是10min，4個(gè)5min。 5、曝光時(shí)間，這個(gè)很重要.我們實(shí)驗(yàn)室也是手動曝光的，要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而來。一般情況下要是能夠觀察到熒光的，那么說明信號強(qiáng)，可以減少曝光時(shí)間，一般壓2-3張片子，10S左右就可以了。選擇最好的一張。如果看不到熒光，說明信號弱，可以曝光10min，我們有曝光30min的，視情況而定。 祝好運(yùn)！ |
11樓2013-07-02 11:01:41
cicelyzh
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2樓2013-07-02 00:34:30
ericyo918
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6樓2013-07-02 08:59:21
cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
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aksand: 金幣+10, ★★★很有幫助 2013-07-02 14:36:16
aksand: 金幣+10, ★★★很有幫助 2013-07-02 14:36:16
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其實(shí)也算不上什么，就是暴光時(shí)間和顯影時(shí)間在一定范圍內(nèi)是可以互相彌補(bǔ)的，就是在顯影時(shí)，通過暗室中微弱的紅光下隨時(shí)觀察膠片develop的情況，當(dāng)隱約出現(xiàn)條帶后終止顯影。下次暴光的時(shí)候可以根據(jù)顯影的速度縮短暴光時(shí)間。當(dāng)然顯影的速度也和顯影液的新舊程度有關(guān)，如果用固定的時(shí)間顯影可能會比較浪費(fèi)膠片。這種手動顯影定影已經(jīng)很少了，很多地方用機(jī)器洗膠片，或者用熒光成像儀直接出圖片。 |
12樓2013-07-02 12:11:20
ericyo918
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15樓2013-07-02 15:52:04
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3樓2013-07-02 02:41:29
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aksand(myprayer代發(fā)): 金幣+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-07-02 09:13:29
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| 多少濃度的膠？ 22kd 和light chain挺近的，如果為了增加信號抗體濃了，可能反而會被屏蔽。 你給個(gè)截圖看看才知道怎么改進(jìn)下 |
4樓2013-07-02 08:03:53
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10樓2013-07-02 10:44:10
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