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btx362237729金蟲 (正式寫手)
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[求助]
求助：相對定量qRT-PCR，需要定量mRNA或者cDNA嗎？
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根據(jù)相對地量的原理，我們要的是目的基因和管家基因的ΔCt值，所以不管模版濃度是多少（稀釋多少倍），這個ΔCt應(yīng)該是不變的才對 就算標(biāo)準(zhǔn)組和待測組的模版起始濃度有差異，應(yīng)該是不會影響到ΔΔCt值才對，因?yàn)棣t這個值不會受到模版起始濃度的影響  那么做相對定量qRT-PCR的時候，還需要去把各個組的起始RNA或者cDNA濃度搞成一致嗎？ 本人覺得不需要啊。。。。但是老師說一定要定量RNA，在反轉(zhuǎn)錄，然后cDNA稀釋相同的倍數(shù)做qRT-PCR就可以了[ Last edited by btx362237729 on 2013-7-4 at 16:41 ] |
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btx362237729
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2樓2013-07-04 22:00:25
niil
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| 你說的已經(jīng)很有道理了.不需要將cDNA搞成一致.但是在做反轉(zhuǎn)錄之前,還是需要定量RNA的,因?yàn)镽NA的多少會影響反轉(zhuǎn)錄的效果,RNA太多,則可能不能夠完全轉(zhuǎn)錄出來所有的cDNA,RNA太少 ,那可能造成cDNA模板濃度低.也就是盡量的讓每一個樣本的RNA達(dá)到一個一致的反轉(zhuǎn)錄效果. |
3樓2013-07-05 08:56:24
0700901104
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【答案】應(yīng)助回帖
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2樓說的很有道理，如果反轉(zhuǎn)錄的時候用的RNA過多反轉(zhuǎn)錄的效率不好，我們使用TaKaRa的熒光用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒一般20ul體系僅需要1ugRNA就足夠了； 對于熒光定量使用相對定量的話之前，目的基因和內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線條件要摸索好，效率越接近100%越好，不行就95%-105%也可以接受。然后將你的模板稀釋后一起跑目的基因和內(nèi)參基因。 |
4樓2013-07-05 09:30:27
btx362237729
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再請問一下，擴(kuò)增效率怎么看的。。。。。 5樓2013-07-07 18:06:13
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