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[求助]
最近RNA提取出現(xiàn)問題，求助各位
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一直用一個試劑盒提RNA,最近出現(xiàn)一種奇怪現(xiàn)象 先附上操作步驟 (1)在液氮中將樣品研磨成粉末，研磨后立刻將樣品轉(zhuǎn)移到Rnase-free離心管中。 (2)加入0.5ml預(yù)冷的pBIOZOL到0.1g樣品粉末中，振蕩混勻5min。室溫放置5分鐘(將離心管橫置使接觸面積最大)，12000 rpm，室溫離心2分鐘。 (3)將上清轉(zhuǎn)移到新的Rnase-free離心管中，加入0.1ml 5MNacl，輕彈離心管（或用漩渦振蕩）混勻。加入0.3ml氯仿，振蕩混勻5min，靜置分層，12000rpm，4℃離心10分鐘。 (4)將上層水相轉(zhuǎn)移到新的Rnase-free離心管中。加入等體積異丙醇，混勻后室溫放置10分鐘。12000 rpm，4℃離心10分鐘。 (5)棄去上清，加1ml 75%乙醇溶液洗滌沉淀，吹打或輕彈使沉淀懸浮，12000 rpm，室溫離心1分鐘。 (6)棄去液體,短暫離心后，用移液器吸干殘余液體，風干沉淀5min。 (7)加10-30Rnase-free水溶解RNA，保存于-80℃。 問題出現(xiàn)在最后沉淀的時候，平時用乙醇沉淀沒有問題的，2.5體積，這兩次發(fā)現(xiàn)用乙醇沉淀后，溶液變成乳濁液的樣子，然后沉淀30min后離心，上層水相，中層沉淀層，底下居然出現(xiàn)大概20ul的不明液體物質(zhì)，水溶性，非氯仿，只好溶解掉再抽提一次，然后就可以了，關(guān)鍵問題是，這個到底是什么原因啊？底下那層液體是什么東東啊？求大蝦給解釋下 |
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3樓2013-07-10 21:20:38
2樓2013-07-10 18:27:46
lmcyjxs
金蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
1988瀟湘: 金幣+5 2013-07-13 14:29:24
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1988瀟湘: 金幣+5 2013-07-13 14:29:24
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1 樓主的步驟里寫著用異丙醇沉淀，后面說加乙醇沉淀有問題，雖然兩者都可以沉淀核酸，但你到底是用什么沉淀的呢？ 2 建議嚴格按照試劑盒再做一遍，要檢測自己的試劑有無加錯，有無污染，環(huán)境各方面是否良好，出現(xiàn)的總會有原因，或者你問問買家，有無這種情況出現(xiàn)。 3 你沉淀的含RNA溶液里，肯定還含有其他物質(zhì)，比如鹽、未除盡的蛋白或其他試劑殘留，假如這樣的話，你加乙醇或異丙醇就很有可能很快出現(xiàn)乳狀物，而且很明顯的 4 至于你說底下不明液體，溶解后沒事，那么不影響你的RNA質(zhì)量，就說明沒有影響，另外你確定它分成3層？有無可能是氣泡？如果你再做一遍，還是這樣，你拍個圖上來給大家分析下？ 以上看能否幫上忙，祝好！ |
4樓2013-07-10 22:20:52
5樓2013-07-12 09:26:47
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