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FAM熒光強度檢測數(shù)值問題 已有7人參與
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| 每次用酶標儀檢測FAM熒光強度時，設(shè)置三組，一樣的東西為什么FAM的熒光值誤差那么大？檢測值為一萬多的時候誤差有3、4千，檢測值為2千的時候誤差有3、4百。。。請問是我加樣的原因還是數(shù)值本身太精確啊。。。 |
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myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-16 17:33:41
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Defintion of mPhotobleaching http://en.wikipedia.org/wiki/Photobleaching Photobleaching is the photochemical destruction of a dye or a fluorophore. In microscopy, photobleaching may complicate the observation of fluorescent molecules, since they will eventually be destroyed by the light exposure necessary to stimulate them into fluorescing. This is especially problematic in time-lapse microscopy. However, photobleaching may also be used prior to applying the (primarily antibody-linked) fluorescent molecules, in an attempt to quench autofluorescence. This can help to improve signal-to-noise ratio. Photobleaching may also be exploited to study the motion and/or diffusion of molecules, for example via the FRAP or FLIP techniques. Loss of activity caused by photobleaching can be controlled by reducing the intensity or time-span of light exposure, by increasing the concentration of fluorophores, by reducing the frequency and thus the photon energy of the input light, or by employing more robust fluorophores that are less prone to bleaching (e.g. Alexa Fluors or DyLight Fluors). To a reasonable approximation, a given molecule will be destroyed after a constant exposure (intensity of emission X emission time X number of cycles) because, in a constant environment, each absorption-emission cycle has an equal probability of causing photobleaching. Photobleaching是光漂白，光漂白影響的是熒光的消光系數(shù)，而不是熒光的波長變化。 熒光光譜的形狀受到兩個因素影響：1.各振動能級之間的跳躍概率，2.基態(tài)中的能級結(jié)構(gòu)。熒光分子受到激發(fā)之后，吸收光子的能量，躍遷到更高級的激發(fā)態(tài)，熒光的高級的激發(fā)態(tài)有較大的分布范圍，所以激發(fā)態(tài)光譜分布較寬，可能有存在多個吸收譜帶，再由不同的激發(fā)態(tài)能級躍遷到基態(tài)，每一種躍遷的能量釋放不同，所以可能有不同的激發(fā)態(tài)。俄而熒光物質(zhì)的振動和內(nèi)轉(zhuǎn)化等非輻射的躍遷過程壽命很短，很快施放能量使分子衰變到激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級，再有這個能級躍遷到基態(tài)，發(fā)射熒光分子。每一種熒光分子的激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級與基態(tài)中的能級的能量值基本上是不變的，所以兩者之間的差值決定了熒光分子的發(fā)射光譜，所以熒光分子的發(fā)射光譜的波長一般比較窄，只有一個譜帶，與吸收光譜的波長無關(guān)。熒光發(fā)射光譜與外界的熒光激發(fā)光譜之間的波長通常有一定差值，叫所謂斯托克位移或者反斯托克位移，斯托克位移是熒光分子的發(fā)射波長比激發(fā)波長長，反斯托克位移是熒光分子的發(fā)射波長比激發(fā)波長短。 但是也有一些熒光分子的分子存在特殊性，激發(fā)波長變化時，熒光發(fā)射光譜會隨之變化，也就是該種熒光分子受激發(fā)出的熒光不全是該種熒光分子的激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級與基態(tài)中的能級之間能量差決定波長的熒光。 所以一般如果出現(xiàn)了熒光分子受激后出現(xiàn)多個波長時，盡量用一種外界的激發(fā)光譜（固定激發(fā)的光源）。 另外，熒光分子的具體的環(huán)境會引起Photobleaching（光漂白），尤其是針對某些波長的熒光，當有多個熒光時可能會剩下另外一些，有時高強度的熒光照射會引起Photobleaching（光漂白），熒光分子用量過大也會引起對某些發(fā)射波長的熒光出現(xiàn)Photobleaching（光漂白）。 |
4樓2013-07-16 10:48:30
凌波麗
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