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田甜思新蟲 (初入文壇)
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[求助]
大腸桿菌總蛋白看不到目的條帶
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| 最近在做重組蛋白的表達(dá)，首先我想看我的目的蛋白有沒有表達(dá)，加了幾個(gè) 對照樣，有marker ，空載體BL21，經(jīng)誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的菌體，但是看不出明顯的條帶。之后為了進(jìn)一步確定我的蛋白有沒有表達(dá)，我又做了純化，純化之后條帶很明顯，而且是單一條帶�？墒菫槭裁淳w總蛋白看不出來呢？希望大家?guī)椭鉀Q下 |
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2樓2013-07-16 08:54:58
田甜思
新蟲 (初入文壇)
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3樓2013-07-16 09:25:04
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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為了提高外源基因的表達(dá)水平，解決方案如下： （1）表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì)：構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)首先要考慮使目標(biāo)基因的翻譯起始密碼ATG 與 SD 序列之間的距離和堿基組成處于一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的變化對 mRNA 的翻譯效率有顯著影響，具體表現(xiàn)為：SD序列 UAAGGAGG的翻譯效率要比 AAGGA 高3-6倍；翻譯起始密碼 ATG 與 UAAGGAGG的最適距離是6-8個(gè)堿基長度，與 AAGAA 的最適距離是5-7個(gè)堿基長度；ATG 與 UAAGGAGG 至少相隔 3-4個(gè)堿基，與 AAGAA 至少相隔5 個(gè)堿基mRNA 的翻譯才能進(jìn)行；ATG與SD序列之間的堿基組成為A，T 堿基豐富時(shí)，mRNA 翻譯效率較高。其次，盡量提高核糖體結(jié)合位點(diǎn)本身和附近的序列中 A/T 堿基的含量，降低mRNA 5’ 端形成的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)的可能性，也是構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)需要注意的事項(xiàng)。在必要的情況下，還可通過定點(diǎn)突變，PCR 等技術(shù)改變個(gè)別關(guān)鍵的堿基來破壞mRNA 5’端的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)。把目標(biāo)基因設(shè)計(jì)成多順反子結(jié)構(gòu)，在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個(gè)SD序列和目標(biāo)基因，一起插入表達(dá)載體。這一方法通常適用于目標(biāo)基因 5’端序列容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，而又不宜改變其序列的情形下。再者，在構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，充分利用各個(gè)基因的結(jié)構(gòu)特征和特點(diǎn)，注意引入翻譯增強(qiáng)子序列。（2）共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因：由于同義密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)對應(yīng)的tRNA的豐度有正比關(guān)系稀有密碼子對應(yīng)的tRNA的豐度很低，有可能在翻譯過程中發(fā)生中止和移碼突變�？刹捎�1.通過基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率高的同義密碼子；2.在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)稀有密碼子tRNA 基因，以提高大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)稀有密碼子 tRNA 的豐度。（3）提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性：利用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把目標(biāo)蛋白最終累積在周質(zhì)空間，或分泌到培養(yǎng)基中；采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌；對分子量較小的目標(biāo)基因進(jìn)行融合表達(dá)或串聯(lián)聚合表達(dá)；共表達(dá)能提高特定目標(biāo)蛋白穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因；對蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行改造；在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。（4）高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞：：大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)過程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個(gè)菌體對目標(biāo)基因的表達(dá)水平基本不變的前提下，通過單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來實(shí)現(xiàn)總表達(dá)量的提高。目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補(bǔ)料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種。工程化宿主細(xì)胞：1.構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌是解決高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長密度較高，培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低，氧氣的不足導(dǎo)致菌體生長速率降低和乙酸的累積，乙酸的存在對目標(biāo)基因的高效表達(dá)有明顯的阻抑作用的根本途徑。利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對氧的利用率的生物學(xué)性質(zhì)，把透明顫菌血紅蛋白基因vgb 導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)以增加其對溶氧的寬容度。從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值；用基因敲除技術(shù)缺失大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因ackA，使從丙酮酸到乙酸的合成途徑被阻斷；改變代謝流的方向，通過共轉(zhuǎn)化把枯草桿菌、釀酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS，單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因 pdc1 和乙醇脫氫酶基因 adh2 導(dǎo)入大腸桿菌，使丙酮酸的代謝有選擇地向生成3-羥基丁酮或乙醇的方向進(jìn)行。2.構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌：rpoH基因編碼大腸桿RNA聚合酶的r32亞基，r32 亞基對大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調(diào)控作用。rpoH 基因缺陷的突變株己經(jīng)被構(gòu)建，研究結(jié)果表明它能明顯提高目標(biāo)基因的表達(dá)水平。 |
4樓2013-07-16 11:33:09
cicelyzh
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
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