kzkz1015

29樓: Originally posted by alicelchf at 2013-07-20 19:09:44
如果你只需要先看看p出來(lái)沒有，你可以25ul體系
另外，我不知道你的primer是多少的濃度，如果10um 你這個(gè)量是沒有問題的
關(guān)鍵的還是反應(yīng)各個(gè)時(shí)間和濃度 hehe...

剛剛算了算，Primer的濃度時(shí)50uM，終濃度是1uM，正好處在takara那個(gè)酶說(shuō)明書的上限，應(yīng)該可以吧

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33樓2013-07-21 15:37:56

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alicelchf

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引用回帖:

33樓: Originally posted by 夏財(cái)神 at 2013-07-21 15:37:56
剛剛算了算，Primer的濃度時(shí)50uM，終濃度是1uM，正好處在takara那個(gè)酶說(shuō)明書的上限，應(yīng)該可以吧...

減少一下吧，50um的話，50ul體系加0.3的樣子足已，太多是p不出的，只會(huì)小分子聚

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修身、齊家、治國(guó)、平天下

34樓2013-07-21 16:10:23

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bluecave

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這種情況我也遇到過(guò)，如果沒有別的失誤，我估計(jì)你是酶用的不對(duì)，我曾經(jīng)調(diào)一個(gè)2000bp左右的基因死活調(diào)不出來(lái)，最后用LA taq做出來(lái)了，雖然說(shuō)普通的taq酶理論上能擴(kuò)3k，但有時(shí)候事情就這么奇葩。你可以把pyrobest和LA都試試。

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35樓2013-07-22 14:16:43

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hyc_charles

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

樓主，我可以告訴你一個(gè)秘密，其實(shí)你做了一段時(shí)間的PCR以后你會(huì)發(fā)現(xiàn)，有些模板和引物，不論你如何調(diào)整PCR條件，不論你如何更換試劑，你都無(wú)法P出你要的目的條帶，或者時(shí)有時(shí)無(wú)。我不知道大家有沒有這種感受，我曾經(jīng)卡在這里2個(gè)月，試了所有辦法，都沒有用。最后把實(shí)驗(yàn)放了一段時(shí)間，再重新用同樣的步驟去做，結(jié)果就出來(lái)了，我表示很無(wú)語(yǔ)……

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不但要做一個(gè)優(yōu)秀的人，更要做一個(gè)無(wú)可取代的人…

36樓2013-07-22 18:42:26

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引用回帖:

36樓: Originally posted by hyc_charles at 2013-07-22 18:42:26
樓主，我可以告訴你一個(gè)秘密，其實(shí)你做了一段時(shí)間的PCR以后你會(huì)發(fā)現(xiàn)，有些模板和引物，不論你如何調(diào)整PCR條件，不論你如何更換試劑，你都無(wú)法P出你要的目的條帶，或者時(shí)有時(shí)無(wú)。我不知道大家有沒有這種感受，我曾經(jīng) ...

前兩天看到一句不錯(cuò)的話：Science is true; don't be misled by the facts.
共勉共勉。

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37樓2013-07-22 21:40:14

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35樓: Originally posted by bluecave at 2013-07-22 14:16:43
這種情況我也遇到過(guò)，如果沒有別的失誤，我估計(jì)你是酶用的不對(duì)，我曾經(jīng)調(diào)一個(gè)2000bp左右的基因死活調(diào)不出來(lái)，最后用LA taq做出來(lái)了，雖然說(shuō)普通的taq酶理論上能擴(kuò)3k，但有時(shí)候事情就這么奇葩。你可以把pyrobest和LA ...

已經(jīng)做出來(lái)了，謝謝

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38樓2013-07-22 21:40:37

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夏財(cái)神

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夏財(cái)神: 回帖置頂 2013-07-22 22:00:10

多謝各位蟲友的幫助，現(xiàn)在已經(jīng)做出了初步結(jié)果�，F(xiàn)在分享一下經(jīng)驗(yàn)。

1、發(fā)現(xiàn)做不出條帶之后，跟同學(xué)討論了下，做了模板DNA的電泳，發(fā)現(xiàn)23K有條帶，初步排除了DNA模板的問題。
2、根據(jù)蟲友的意見，Blast了引物的特異性，并重新計(jì)算了引物的濃度，發(fā)現(xiàn)引物濃度略高，在體系中做了適當(dāng)調(diào)整。
3、找到了Taq酶的說(shuō)明書，重新校對(duì)了酶、緩沖溶液、dNTP、模板的終濃度要求（發(fā)現(xiàn)dNTP濃度低了）；同時(shí)根據(jù)說(shuō)明書調(diào)整了PCR反應(yīng)條件（變性和退火說(shuō)明書要求30s即可，延伸時(shí)間調(diào)整到了1.5min），并根據(jù)蟲友的意見進(jìn)行了溫度梯度PCR。

主要是做了上述工作，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了調(diào)整。今天的實(shí)驗(yàn)結(jié)果目的基因條帶比較清晰，多謝諸位蟲友的幫忙！

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hyc_charles

39樓2013-07-22 21:59:28

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hyc_charles

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引用回帖:

39樓: Originally posted by 夏財(cái)神 at 2013-07-22 21:59:28
多謝各位蟲友的幫助，現(xiàn)在已經(jīng)做出了初步結(jié)果。現(xiàn)在分享一下經(jīng)驗(yàn)。

1、發(fā)現(xiàn)做不出條帶之后，跟同學(xué)討論了下，做了模板DNA的電泳，發(fā)現(xiàn)23K有條帶，初步排除了DNA模板的問題。
2、根據(jù)蟲友的意見，Blast了引物的特 ...

贊賞和感謝樓主這一做法，記得在大家的幫助之后分享自己的心得，很多帖子一旦自己做出來(lái)了，就銷聲匿跡了，頂��！

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40樓2013-07-23 10:34:50

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