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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » PCR擴增DNA序列無條帶
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[求助]
PCR擴增DNA序列無條帶
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最近設計了幾對引物分別擴增E. coli和P. aeruginosa的兩個基因，但一直沒有跑出條帶，請高手們指點一下。 想要擴增的目的基因分別為1500 bp和1200 bp，在NCBI找到相應基因后，用MIT的Primer3設計了引物，Tm≈59，GC%在50~55%，引物長20 b。 PCR擴增條件：94°C 4 min；94°C 1 min；54°C 1 min；72°C 1 min；72°C 7 min。跑了27個循環(huán)。電泳之后沒有條帶。 考慮沒有條帶的原因可能是：模板、Taq酶、反應條件等，又做了下試驗。 1、模板是基因組DNA，直接電泳后發(fā)現(xiàn)23 kb有明顯條帶，那應該模板沒問題。 2、Taq酶是Takara的，前幾天同學剛用過，按理說也沒問題，而且我也重新做了實驗，分別用Takara和Invitrogen的酶跑PCR，都沒與條帶。 3、引物可能設計的有問題，我用原來跑出過條帶的16s引物做了對照，如果16s跑出來那肯定就是引物問題，但都沒有條帶就不好說了。但是這個條件16s也跑不出來了... 無法確診 4、重新調整退火溫度到56°C，同樣無條帶。 求諸位高手幫忙分析下，PCR失敗的原因可能會什么��？萬分感謝！！ |
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夏財神: 回帖置頂 2013-07-22 22:00:10
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多謝各位蟲友的幫助，現(xiàn)在已經(jīng)做出了初步結果�，F(xiàn)在分享一下經(jīng)驗。 1、發(fā)現(xiàn)做不出條帶之后，跟同學討論了下，做了模板DNA的電泳，發(fā)現(xiàn)23K有條帶，初步排除了DNA模板的問題。 2、根據(jù)蟲友的意見，Blast了引物的特異性，并重新計算了引物的濃度，發(fā)現(xiàn)引物濃度略高，在體系中做了適當調整。 3、找到了Taq酶的說明書，重新校對了酶、緩沖溶液、dNTP、模板的終濃度要求（發(fā)現(xiàn)dNTP濃度低了）；同時根據(jù)說明書調整了PCR反應條件（變性和退火說明書要求30s即可，延伸時間調整到了1.5min），并根據(jù)蟲友的意見進行了溫度梯度PCR。 主要是做了上述工作，并對反應條件進行了調整。今天的實驗結果目的基因條帶比較清晰，多謝諸位蟲友的幫忙！ |
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39樓2013-07-22 21:59:28
凌波麗
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
夏財神(myprayer代發(fā)): 金幣+1, 贈人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-20 10:46:28
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PCR不出現(xiàn)擴增條帶 樓主的情況是不出現(xiàn)擴增條帶，問題與解決如下： PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有:1模板核酸的制備，2引物的質量與特異性，3.酶的質量，4. Mg2+ 濃度，5.物理原因，6.靶序列變異。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究,最后寫出了調整順序�！� 1.模板：(1)模板中含有雜蛋白質，(2)模板中含有Taq酶抑制劑，(3)模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，(4)在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。(5)模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。 2.酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠�！� 3.引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：(1)選定一個好的引物合成單位。(2)引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。(3)引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。(4)引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等�！� 4.Mg2+ 濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶�！ 》磻w積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20μL、30μL、50μL。或100μL，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20μL 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。 5.物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一�！ � 6.靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。 一般的調整順序：若PCR反應后無任何產物，可先調整Mg2+ 濃度，Mg2+ 濃度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，調整時從低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 濃度為1.5mmol/L。 然后調整引物濃度，在調整引物與模板的結合溫度。再往后，重新提取DNA模板、換酶和改變反應體積。最后這些都做了仍未奏效，那么就要重新設計引物了。 過去，我也回答過PCR無產物的問題，但是這次回答按照近日我更新以后的內容回答。 看來PCR 的問題是多，這是我在兩天里第三次回答同類問題。 |
7樓2013-07-19 23:17:45
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謝謝，不過這個都太籠統(tǒng)了吧。 我前面給出了具體的條件和后續(xù)探索，希望這位高手能仔細看過之后再回答吧。 具體： 1、模板，前面提到是采用Omega的試劑盒提取，并經(jīng)過電泳確認了，怎么再判斷它是否有問題？ 2、已經(jīng)用兩種酶做過了 3、引物，這里講的很有幫助，到時候給引物跑一下PCR。引物使用Primer3設計的，程序是否有問題？其他的引物參數(shù)我也提供了... 4、鎂離子在Buffer中提供了，沒有精確控制。而這里不應該是Mg2+的原因，因為做16s的時候也沒擴出來，而之前用同樣buffer是可以的 5、準備做溫度梯度，但是溫度和時間如何設定呢？ 6、菌株來自CGSC，通過NCBI查到序列設計的引物 懇請根據(jù)具體情況仔細幫忙分析下，謝謝！ |
9樓2013-07-20 00:04:09
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