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[求助]
PCR擴(kuò)增DNA序列無條帶
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最近設(shè)計(jì)了幾對引物分別擴(kuò)增E. coli和P. aeruginosa的兩個(gè)基因，但一直沒有跑出條帶，請高手們指點(diǎn)一下。 想要擴(kuò)增的目的基因分別為1500 bp和1200 bp，在NCBI找到相應(yīng)基因后，用MIT的Primer3設(shè)計(jì)了引物，Tm≈59，GC%在50~55%，引物長20 b。 PCR擴(kuò)增條件：94°C 4 min；94°C 1 min；54°C 1 min；72°C 1 min；72°C 7 min。跑了27個(gè)循環(huán)。電泳之后沒有條帶。 考慮沒有條帶的原因可能是：模板、Taq酶、反應(yīng)條件等，又做了下試驗(yàn)。 1、模板是基因組DNA，直接電泳后發(fā)現(xiàn)23 kb有明顯條帶，那應(yīng)該模板沒問題。 2、Taq酶是Takara的，前幾天同學(xué)剛用過，按理說也沒問題，而且我也重新做了實(shí)驗(yàn)，分別用Takara和Invitrogen的酶跑PCR，都沒與條帶。 3、引物可能設(shè)計(jì)的有問題，我用原來跑出過條帶的16s引物做了對照，如果16s跑出來那肯定就是引物問題，但都沒有條帶就不好說了。但是這個(gè)條件16s也跑不出來了... 無法確診 4、重新調(diào)整退火溫度到56°C，同樣無條帶。 求諸位高手幫忙分析下，PCR失敗的原因可能會(huì)什么�。咳f分感謝��！ |
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3樓2013-07-19 19:59:40
kapa1
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2樓2013-07-19 19:52:38
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4樓2013-07-19 20:40:00
5樓2013-07-19 21:16:43
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