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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » PCR擴增DNA序列無條帶
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PCR擴增DNA序列無條帶
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最近設計了幾對引物分別擴增E. coli和P. aeruginosa的兩個基因，但一直沒有跑出條帶，請高手們指點一下。 想要擴增的目的基因分別為1500 bp和1200 bp，在NCBI找到相應基因后，用MIT的Primer3設計了引物，Tm≈59，GC%在50~55%，引物長20 b。 PCR擴增條件：94°C 4 min；94°C 1 min；54°C 1 min；72°C 1 min；72°C 7 min。跑了27個循環(huán)。電泳之后沒有條帶。 考慮沒有條帶的原因可能是：模板、Taq酶、反應條件等，又做了下試驗。 1、模板是基因組DNA，直接電泳后發(fā)現(xiàn)23 kb有明顯條帶，那應該模板沒問題。 2、Taq酶是Takara的，前幾天同學剛用過，按理說也沒問題，而且我也重新做了實驗，分別用Takara和Invitrogen的酶跑PCR，都沒與條帶。 3、引物可能設計的有問題，我用原來跑出過條帶的16s引物做了對照，如果16s跑出來那肯定就是引物問題，但都沒有條帶就不好說了。但是這個條件16s也跑不出來了... 無法確診 4、重新調整退火溫度到56°C，同樣無條帶。 求諸位高手幫忙分析下，PCR失敗的原因可能會什么��？萬分感謝��！ |
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bullfrog325
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