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yangqi金蟲 (小有名氣)
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[求助]
RT-PCR的cDNA不能擴(kuò)增出目的條帶，只有內(nèi)參基因能擴(kuò)增出來
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大家好！ 我近期在做RT-PCR，一共有四個(gè)模板，來源于同一個(gè)細(xì)菌。內(nèi)參選擇的是16sRNA，另外還選擇了兩對(duì)目的基因。 提取RNA后，經(jīng)DNA酶消化后，以反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA為模板，用普通PCR擴(kuò)增，但是只有16sRNA是在每個(gè)樣本中都可以得到的，目的基因在其中的兩個(gè)樣本中無法得到，不知道是什么原因。求各位高手解惑！ 這是我所提RNA的圖片，其中第1、2、3泳道為1、2、3樣本，后面兩個(gè)泳道為第4個(gè)樣本。 逆轉(zhuǎn)錄后得到的圖如下，基因分別為16sRNA、目的基因1和2（從右到左）。泳道有點(diǎn)糊的是DNA做的陽參。 后面我又重新做了一次，結(jié)果更差了 希望大家批評(píng)指正，感激不盡！ 第二次的結(jié)果 第一次的結(jié)果 RNA檢測(cè)的結(jié)果 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-08-10 13:53:30
yangqi: 金幣+100, ★★★很有幫助, 謝謝！ 2012-08-10 16:04:25
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1.樓主的基因是否為低拷貝基因？我曾經(jīng)克隆一個(gè)低拷貝基因，提了50個(gè)RNA樣品，只有3個(gè)擴(kuò)增出來了。樓主擴(kuò)增不出可能跟所提樣品太少有關(guān)系。 2.樓主的基因是否是較長(zhǎng)片段？由于RNA降解導(dǎo)致cDNA不完整，如果片段較長(zhǎng)也可能擴(kuò)增不出來，建議樓主分段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行拼接。 3.建議使用活性較高的taq酶進(jìn)行pcr，有些高保真的酶就是擴(kuò)不出來。 4.建議樓主在目的基因內(nèi)部（最好是3‘端）設(shè)計(jì)較短序列的一對(duì)引物，對(duì)你這三個(gè)樣品進(jìn)行pcr看看。 |
2樓2012-08-10 12:50:07
4樓2012-08-10 16:12:47
yangqi
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3樓2012-08-10 16:08:39
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10樓2012-08-12 21:32:52
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