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yangqi金蟲 (小有名氣)
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[求助]
RT-PCR的cDNA不能擴增出目的條帶，只有內參基因能擴增出來
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大家好！ 我近期在做RT-PCR，一共有四個模板，來源于同一個細菌。內參選擇的是16sRNA，另外還選擇了兩對目的基因。 提取RNA后，經DNA酶消化后，以反轉錄后得到cDNA為模板，用普通PCR擴增，但是只有16sRNA是在每個樣本中都可以得到的，目的基因在其中的兩個樣本中無法得到，不知道是什么原因。求各位高手解惑！ 這是我所提RNA的圖片，其中第1、2、3泳道為1、2、3樣本，后面兩個泳道為第4個樣本。 逆轉錄后得到的圖如下，基因分別為16sRNA、目的基因1和2（從右到左）。泳道有點糊的是DNA做的陽參。 后面我又重新做了一次，結果更差了 希望大家批評指正，感激不盡！ 第二次的結果 第一次的結果 RNA檢測的結果 |
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yangqi
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9樓2012-08-11 09:18:10
【答案】應助回帖
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1.樓主的基因是否為低拷貝基因？我曾經克隆一個低拷貝基因，提了50個RNA樣品，只有3個擴增出來了。樓主擴增不出可能跟所提樣品太少有關系。 2.樓主的基因是否是較長片段？由于RNA降解導致cDNA不完整，如果片段較長也可能擴增不出來，建議樓主分段設計引物進行拼接。 3.建議使用活性較高的taq酶進行pcr，有些高保真的酶就是擴不出來。 4.建議樓主在目的基因內部（最好是3‘端）設計較短序列的一對引物，對你這三個樣品進行pcr看看。 |
2樓2012-08-10 12:50:07
yangqi
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3樓2012-08-10 16:08:39
4樓2012-08-10 16:12:47
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