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[求助]
PCR擴(kuò)增DNA序列無(wú)條帶
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最近設(shè)計(jì)了幾對(duì)引物分別擴(kuò)增E. coli和P. aeruginosa的兩個(gè)基因，但一直沒(méi)有跑出條帶，請(qǐng)高手們指點(diǎn)一下。 想要擴(kuò)增的目的基因分別為1500 bp和1200 bp，在NCBI找到相應(yīng)基因后，用MIT的Primer3設(shè)計(jì)了引物，Tm≈59，GC%在50~55%，引物長(zhǎng)20 b。 PCR擴(kuò)增條件：94°C 4 min；94°C 1 min；54°C 1 min；72°C 1 min；72°C 7 min。跑了27個(gè)循環(huán)。電泳之后沒(méi)有條帶。 考慮沒(méi)有條帶的原因可能是：模板、Taq酶、反應(yīng)條件等，又做了下試驗(yàn)。 1、模板是基因組DNA，直接電泳后發(fā)現(xiàn)23 kb有明顯條帶，那應(yīng)該模板沒(méi)問(wèn)題。 2、Taq酶是Takara的，前幾天同學(xué)剛用過(guò)，按理說(shuō)也沒(méi)問(wèn)題，而且我也重新做了實(shí)驗(yàn)，分別用Takara和Invitrogen的酶跑PCR，都沒(méi)與條帶。 3、引物可能設(shè)計(jì)的有問(wèn)題，我用原來(lái)跑出過(guò)條帶的16s引物做了對(duì)照，如果16s跑出來(lái)那肯定就是引物問(wèn)題，但都沒(méi)有條帶就不好說(shuō)了。但是這個(gè)條件16s也跑不出來(lái)了... 無(wú)法確診 4、重新調(diào)整退火溫度到56°C，同樣無(wú)條帶。 求諸位高手幫忙分析下，PCR失敗的原因可能會(huì)什么��？萬(wàn)分感謝��！ |
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凌波麗
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PCR不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶 樓主的情況是不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，問(wèn)題與解決如下： PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有:1模板核酸的制備，2引物的質(zhì)量與特異性，3.酶的質(zhì)量，4. Mg2+ 濃度，5.物理原因，6.靶序列變異。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究,最后寫(xiě)出了調(diào)整順序�！� 1.模板：(1)模板中含有雜蛋白質(zhì)，(2)模板中含有Taq酶抑制劑，(3)模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，(4)在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。(5)模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。 2.酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。 3.引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng)，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增，對(duì)策為：(1)選定一個(gè)好的引物合成單位。(2)引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。(3)引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。(4)引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等�！� 4.Mg2+ 濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶�！ 》磻�(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20μL、30μL、50μL。或100μL，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20μL 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。 5.物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一�！ � 6.靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。 一般的調(diào)整順序：若PCR反應(yīng)后無(wú)任何產(chǎn)物，可先調(diào)整Mg2+ 濃度，Mg2+ 濃度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，調(diào)整時(shí)從低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 濃度為1.5mmol/L。 然后調(diào)整引物濃度，在調(diào)整引物與模板的結(jié)合溫度。再往后，重新提取DNA模板、換酶和改變反應(yīng)體積。最后這些都做了仍未奏效，那么就要重新設(shè)計(jì)引物了。 過(guò)去，我也回答過(guò)PCR無(wú)產(chǎn)物的問(wèn)題，但是這次回答按照近日我更新以后的內(nèi)容回答。 看來(lái)PCR 的問(wèn)題是多，這是我在兩天里第三次回答同類(lèi)問(wèn)題。 |
7樓2013-07-19 23:17:45
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謝謝，不過(guò)這個(gè)都太籠統(tǒng)了吧。 我前面給出了具體的條件和后續(xù)探索，希望這位高手能仔細(xì)看過(guò)之后再回答吧。 具體： 1、模板，前面提到是采用Omega的試劑盒提取，并經(jīng)過(guò)電泳確認(rèn)了，怎么再判斷它是否有問(wèn)題？ 2、已經(jīng)用兩種酶做過(guò)了 3、引物，這里講的很有幫助，到時(shí)候給引物跑一下PCR。引物使用Primer3設(shè)計(jì)的，程序是否有問(wèn)題？其他的引物參數(shù)我也提供了... 4、鎂離子在Buffer中提供了，沒(méi)有精確控制。而這里不應(yīng)該是Mg2+的原因，因?yàn)樽?6s的時(shí)候也沒(méi)擴(kuò)出來(lái)，而之前用同樣buffer是可以的 5、準(zhǔn)備做溫度梯度，但是溫度和時(shí)間如何設(shè)定呢？ 6、菌株來(lái)自CGSC，通過(guò)NCBI查到序列設(shè)計(jì)的引物 懇請(qǐng)根據(jù)具體情況仔細(xì)幫忙分析下，謝謝！ |
9樓2013-07-20 00:04:09
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夏財(cái)神: 金幣+5, ★★★很有幫助, 菌液PCR，雖然沒(méi)有用，好建議 2013-07-22 21:45:13
| 你模板的量是多少？我之前用的菌液直接做PCR ，也能擴(kuò)出來(lái)，你也可以試試，可以避免你在提基因組的過(guò)程中的錯(cuò)誤。 |
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6樓2013-07-19 22:21:12
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8樓2013-07-19 23:35:34
10樓2013-07-20 00:08:34
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