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夏日小黃瓜金蟲 (初入文壇)
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[求助]
以酵母基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增沒有條帶
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實(shí)驗(yàn)室有三株構(gòu)建好的畢赤酵母工程菌 都帶有我需要的目的基因（大小約為2kb） 我用酵母基因組提取試劑盒分別提取了三者的基因組 用目的基因的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 使用的是Taq酶（想要先確保能夠擴(kuò)增出來再使用高保真酶） 預(yù)變性94℃×5min 變性94℃×30s 退火55℃×30s 延伸72℃×2min 補(bǔ)延伸72℃×10min 4℃∞ 30個(gè)循環(huán) 其中只有一種酵母基因組擴(kuò)增出了我要的條帶 但是測序表明有很多點(diǎn)突變和堿基缺失 后來我改變退火溫度51，53，55，57，59都試過 每次都帶有P得出結(jié)果的那個(gè)基因組做對照 還是沒條帶 我想請教一下： 1.如何能從另兩種酵母基因組擴(kuò)增出條帶？ 2.就算擴(kuò)增出條帶，能夠保證測序正確么？為什么穿梭質(zhì)粒構(gòu)建好了也測序正確的，重組到酵母基因組中之后再次擴(kuò)增目的基因會有這么多的缺失和點(diǎn)突變呢？如果缺失和突變不能避免，那么用酵母基因組作為模板可靠嗎？ 多謝�。�！ |
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