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雪山飛狐7233鐵桿木蟲 (著名寫手)
鐵桿小蟲
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[交流]
基因組中長片段PCR應(yīng)該注意的幾個問題 已有12人參與
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1.當(dāng)PCR結(jié)果不滿意時,考慮以下幾個方面1)將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼,(2)使用50ul或更少反應(yīng)體系時,勿使用AmpliWax,兩個反應(yīng)混合液=的操作方式在大多數(shù)情況下很有效,(3)當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70度"熱啟動"開始循環(huán)時,切記在加入酶后稍微振蕩一下,因為在0.2ml的PCR管不能均勻傳熱.(4)不要隨意減少dNTP的用量,必需與其他成分保持平衡. 2.沒有擴(kuò)增產(chǎn)物1)在提供氯化鎂緩沖液中,以0.25mmol/L為梯度增加氯化鎂濃度,(2)泳道中出現(xiàn)模糊條帶,如果DNA模板中存在RNA,按上訴提示濃度補(bǔ)加氯化鎂,因為在PCR反應(yīng)中可能缺少游離的鎂離子.(3)在融化試劑時,將第三緩沖液在15-25度溫育后混勻,若還有晶體狀物質(zhì),放置過夜混勻后可再次使用.(4)檢查退火溫度和變性條件,如果需要可降低退火溫度.(5)檢查模板和引物的用量.增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量. 3.泳道中出現(xiàn)模糊條帶1)減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量,(2)提高退火溫度,單不要超過68度,(3)重新設(shè)計引物或設(shè)計更長的引物. 4其他值得注意的條件1)建議使用0.2ml的薄壁管,因為厚壁管在92度時不能有效的使模板變性.(2)最佳反應(yīng)體積為50ul,最好泳30ul礦物油覆蓋,(3)在大多數(shù)反應(yīng)中,0.75ul(0.5-1.0ul)的酶量可以得到滿意的結(jié)果,(4)建議使用1.75mmol/L氯化鎂:350mmol/LdNTP或2.25mmol/L氯化鎂:500LNTP組合的混合物,要得到最佳結(jié)果,優(yōu)化鎂離子的濃度是必需的.(5)基因組DNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng),因此最好泳瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的長度.DNA片段長度可以超過50KB,傳統(tǒng)的基因組DNA能擴(kuò)增片段至10KB,要擴(kuò)增更長的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA.(7)降低二級結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性.進(jìn)行長片段PCR擴(kuò)增時,引物長度一般為24-34個核苷酸,熔點在63068度之間,使用這類引物可提高PCR反應(yīng)的退火溫度來增加反應(yīng)的特異性,這點非常重要,長片段擴(kuò)增的效果往往受到非特異性短片度優(yōu)先擴(kuò)增的影響,變性:第一步變性在92-94度下進(jìn)行2分鐘,在循環(huán)過程中盡可能減少變性時間(92-94度下19秒),除非模板中富含GC,則95度下變性30秒,這可以防止DNA脫平嘌呤核鏈斷裂,對于需擴(kuò)增的基因組DNA片段終長度超過12KB時,應(yīng)盡可能降低變性溫度.(9)延伸:68度下進(jìn)行延伸.(10)循環(huán)延伸:盡量采用循環(huán)延伸的條件,若PCR儀無此功能,則必需增加延伸的時間.(11)長片段PCR系統(tǒng)擴(kuò)增的片段其3'-末端油一個突出的A,因此建議采用T/A克隆.若進(jìn)行平端克隆,可用Klenow酶或T4DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補(bǔ)平后在進(jìn)行.(12)測序時因酶的混合物帶有3'-5'外切酶活性,用Sanger方法進(jìn)行測序不能產(chǎn)生均一的(染色體)帶型 [ Last edited by 雪山飛狐7233 on 2011-10-11 at 15:57 ] |
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