 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 3071 | 回復(fù): 14 | |||
雪山飛狐7233鐵桿木蟲 (著名寫手)
鐵桿小蟲
|
[交流]
基因組中長(zhǎng)片段PCR應(yīng)該注意的幾個(gè)問(wèn)題 已有12人參與
|
|
1.當(dāng)PCR結(jié)果不滿意時(shí),考慮以下幾個(gè)方面1)將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼,(2)使用50ul或更少反應(yīng)體系時(shí),勿使用AmpliWax,兩個(gè)反應(yīng)混合液=的操作方式在大多數(shù)情況下很有效,(3)當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70度"熱啟動(dòng)"開始循環(huán)時(shí),切記在加入酶后稍微振蕩一下,因?yàn)樵?.2ml的PCR管不能均勻傳熱.(4)不要隨意減少dNTP的用量,必需與其他成分保持平衡. 2.沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物1)在提供氯化鎂緩沖液中,以0.25mmol/L為梯度增加氯化鎂濃度,(2)泳道中出現(xiàn)模糊條帶,如果DNA模板中存在RNA,按上訴提示濃度補(bǔ)加氯化鎂,因?yàn)樵赑CR反應(yīng)中可能缺少游離的鎂離子.(3)在融化試劑時(shí),將第三緩沖液在15-25度溫育后混勻,若還有晶體狀物質(zhì),放置過(guò)夜混勻后可再次使用.(4)檢查退火溫度和變性條件,如果需要可降低退火溫度.(5)檢查模板和引物的用量.增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量. 3.泳道中出現(xiàn)模糊條帶1)減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量,(2)提高退火溫度,單不要超過(guò)68度,(3)重新設(shè)計(jì)引物或設(shè)計(jì)更長(zhǎng)的引物. 4其他值得注意的條件1)建議使用0.2ml的薄壁管,因?yàn)楹癖诠茉?2度時(shí)不能有效的使模板變性.(2)最佳反應(yīng)體積為50ul,最好泳30ul礦物油覆蓋,(3)在大多數(shù)反應(yīng)中,0.75ul(0.5-1.0ul)的酶量可以得到滿意的結(jié)果,(4)建議使用1.75mmol/L氯化鎂:350mmol/LdNTP或2.25mmol/L氯化鎂:500LNTP組合的混合物,要得到最佳結(jié)果,優(yōu)化鎂離子的濃度是必需的.(5)基因組DNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng),因此最好泳瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的長(zhǎng)度.DNA片段長(zhǎng)度可以超過(guò)50KB,傳統(tǒng)的基因組DNA能擴(kuò)增片段至10KB,要擴(kuò)增更長(zhǎng)的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA.(7)降低二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性.進(jìn)行長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增時(shí),引物長(zhǎng)度一般為24-34個(gè)核苷酸,熔點(diǎn)在63068度之間,使用這類引物可提高PCR反應(yīng)的退火溫度來(lái)增加反應(yīng)的特異性,這點(diǎn)非常重要,長(zhǎng)片段擴(kuò)增的效果往往受到非特異性短片度優(yōu)先擴(kuò)增的影響,變性:第一步變性在92-94度下進(jìn)行2分鐘,在循環(huán)過(guò)程中盡可能減少變性時(shí)間(92-94度下19秒),除非模板中富含GC,則95度下變性30秒,這可以防止DNA脫平嘌呤核鏈斷裂,對(duì)于需擴(kuò)增的基因組DNA片段終長(zhǎng)度超過(guò)12KB時(shí),應(yīng)盡可能降低變性溫度.(9)延伸:68度下進(jìn)行延伸.(10)循環(huán)延伸:盡量采用循環(huán)延伸的條件,若PCR儀無(wú)此功能,則必需增加延伸的時(shí)間.(11)長(zhǎng)片段PCR系統(tǒng)擴(kuò)增的片段其3'-末端油一個(gè)突出的A,因此建議采用T/A克隆.若進(jìn)行平端克隆,可用Klenow酶或T4DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補(bǔ)平后在進(jìn)行.(12)測(cè)序時(shí)因酶的混合物帶有3'-5'外切酶活性,用Sanger方法進(jìn)行測(cè)序不能產(chǎn)生均一的(染色體)帶型 [ Last edited by 雪山飛狐7233 on 2011-10-11 at 15:57 ] |
回復(fù)此樓» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
零點(diǎn)關(guān)機(jī)» 猜你喜歡
0817 化學(xué)工程 299分求調(diào)劑 有科研經(jīng)歷 有二區(qū)文章
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
0854可跨調(diào)劑，一作一項(xiàng)核心論文五項(xiàng)專利，省、國(guó)級(jí)證書40+數(shù)一英一287
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
070300化學(xué)319求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
一志愿985，本科211，0817化學(xué)工程與技術(shù)319求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
一志愿西南交大，求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
286求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
焦慮
已經(jīng)有11人回復(fù)
-
331求調(diào)劑（0703有機(jī)化學(xué)
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
298-一志愿中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)-求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
297求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 求長(zhǎng)片段pcr擴(kuò)增大神�。。。。�
已經(jīng)有22人回復(fù)
- 基因組DNA做模板擴(kuò)增目的片段比cDND擴(kuò)增得到的短
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 10kb長(zhǎng)片段pcr參數(shù)該設(shè)置什么
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 如何確定自己的目的片段 PCR 痛苦中
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 基因組DNA模板質(zhì)量對(duì)PCR有什么影響
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 大神請(qǐng)留步�。。￠L(zhǎng)片段ＰＣＲ擴(kuò)增�。�！
已經(jīng)有5人回復(fù)
- PCR的操作應(yīng)注意什么？
已經(jīng)有8人回復(fù)
- PCR大片段問(wèn)題
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 求長(zhǎng)片段（7.5 kb）PCR擴(kuò)增方法？
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 兩個(gè)基因片段的連接問(wèn)題？
已經(jīng)有11人回復(fù)
- PCR時(shí) DNA模版過(guò)多會(huì)影響PCR的結(jié)果嗎？？
已經(jīng)有21人回復(fù)
- 3個(gè)片段的重疊延伸pcr,pcr反應(yīng)條件？
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 如何利用基因組DNA進(jìn)行real time PCR ？？？？
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 短片段PCR擴(kuò)增
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 基因組PCR的問(wèn)題
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 短基因片段合成的相關(guān)問(wèn)題求助
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 提基因組的時(shí)候做第一次PCR效果很好，但是直接以PCR產(chǎn)物做第二次PCR的模版后...
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 大片段PCR(2.1K)擴(kuò)增求助
已經(jīng)有12人回復(fù)
- AutoCAD中圖塊使用必須注意的幾個(gè)問(wèn)題
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 環(huán)狀基因組的PCR
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 求助 土壤基因組 PCR 擴(kuò)增問(wèn)題
已經(jīng)有30人回復(fù)
- PCR總是無(wú)法正確擴(kuò)增所需片段，問(wèn)題在哪？
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】在真菌基因組中PCR基因，難嗎？
已經(jīng)有18人回復(fù)
- 【求助/交流】5500bp的片段PCR問(wèn)題
已經(jīng)有21人回復(fù)
 |
2樓2011-10-11 13:55:27
3樓2011-10-11 15:55:46
asznpb
木蟲 (正式寫手)
- BioEPI: 7
- 應(yīng)助: 12 (小學(xué)生)
- 金幣: 4032.8
- 散金: 615
- 紅花: 12
- 帖子: 630
- 在線: 422.7小時(shí)
- 蟲號(hào): 820881
- 注冊(cè): 2009-08-03
- 性別: GG
- 專業(yè): 合成藥物化學(xué)
4樓2011-10-11 16:14:45
 |
5樓2011-10-11 17:21:08
longkobe
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 2104.7
- 帖子: 334
- 在線: 44.1小時(shí)
- 蟲號(hào): 653570
- 注冊(cè): 2008-11-13
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
6樓2011-10-12 10:12:37
亞爾梅爾
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 112.5
- 帖子: 30
- 在線: 9.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 1095815
- 注冊(cè): 2010-09-11
- 專業(yè): 環(huán)境微生物學(xué)
7樓2011-11-13 16:25:50
rivergf
銅蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 121.4
- 帖子: 86
- 在線: 13.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 814081
- 注冊(cè): 2009-07-22
- 性別: GG
- 專業(yè): 環(huán)境微生物學(xué)
8樓2011-12-09 20:19:44
xiezhenrong
金蟲 (正式寫手)
北斗星
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 631.4
- 散金: 17
- 紅花: 1
- 帖子: 378
- 在線: 82.4小時(shí)
- 蟲號(hào): 460911
- 注冊(cè): 2007-11-18
- 性別: MM
- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
9樓2012-03-09 11:00:44
sunwei57
木蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 26 (小學(xué)生)
- 金幣: 4093.2
- 帖子: 225
- 在線: 84.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 1696471
- 注冊(cè): 2012-03-16
- 專業(yè): 基因表達(dá)調(diào)控與表觀遺傳學(xué)
10樓2012-03-18 23:25:26
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 雪山飛狐7233 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 344求調(diào)劑 +5 | knight344 2026-03-16 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 能源材料化學(xué)課題組招收碩士研究生8-10名 +4 | 脫穎而出 2026-03-16 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 考研求調(diào)劑 +3 | 橘頌. 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085601材料工程專碩求調(diào)劑 +5 | 慕寒mio 2026-03-16 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 化學(xué)調(diào)劑0703 +8 | 啊我我的 2026-03-11 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 318求調(diào)劑 +3 | Yanyali 2026-03-15 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +3 | 曼殊2266 2026-03-14 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑 +10 | 小樓。 2026-03-12 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 0703 物理化學(xué)調(diào)劑 +3 | 我可以上岸的對(duì)?/a> 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 本科南京大學(xué)一志愿川大藥學(xué)327 +3 | 麥田耕者 2026-03-14 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿哈工大材料324分求調(diào)劑 +5 | 閆旭東 2026-03-14 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 308 085701 四六級(jí)已過(guò)求調(diào)劑 +7 | 溫喬喬喬喬 2026-03-12 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 求材料調(diào)劑 +5 | 隔壁陳先生 2026-03-12 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +9 | Koxui 2026-03-12 | 11/550 |
|
|
|
[碩博家園] 085600 260分求調(diào)劑 +3 | 天空還下雨么 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑 +7 | 綠豆芹菜湯 2026-03-12 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 274求調(diào)劑 +3 | S.H1 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[論文投稿]
投稿問(wèn)題
 5+4
|
星光燦爛xt 2026-03-12 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 070303一志愿西北大學(xué)學(xué)碩310找調(diào)劑 +3 | d如愿上岸 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑，材料、化工皆可 +8 | 蘇打水7777 2026-03-11 | 10/500 |
|