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ada800515新蟲 (初入文壇)
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[求助]
如何利用基因組DNA進(jìn)行real time PCR ？？？？
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求助利用基因組DNA進(jìn)行real-time PCR的相關(guān)問題。急急急急急！��！ 我先介紹下試驗(yàn)設(shè)計：最近想要進(jìn)行一個實(shí)驗(yàn)，是對基因組DNA進(jìn)行葡萄糖基化修飾，然后利用內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，在酶切位點(diǎn)的兩端設(shè)計引物，并進(jìn)行real-time PCR。如果內(nèi)切酶識別的酶切位點(diǎn)被修飾了，則切不斷；反之，沒被修飾的能夠切斷。這樣在酶切位點(diǎn)兩端設(shè)計引物，進(jìn)行real-time PCR，如果有擴(kuò)增的片段，就證明酶切位點(diǎn)被修飾了，因?yàn)樾揎椀奈稽c(diǎn)不能被切斷；反之，沒有擴(kuò)增片段就證明這個位點(diǎn)沒有被修飾。real-time PCR的結(jié)果就能體現(xiàn)修飾后，基因組DNA上酶切位點(diǎn)的修飾程度。 我現(xiàn)在有幾個問題： 1.之前都是用mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，然后用cDNA做模板進(jìn)行real-time PCR，為了看基因的表達(dá)，這類real-time PCR可以選用GAPDH或者18S做內(nèi)參。沒做過用基因組DNA做模板進(jìn)行real-time PCR。如果用基因組DNA做模板進(jìn)行real-time PCR的話，應(yīng)該選用什么做內(nèi)參？ 2.如果用相對定量法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組與對照組之間的比較，可以用2-△△CT法嗎？ 3.如果不能用2-△△CT法，用什么方法檢測實(shí)驗(yàn)組與對照組的差別。 還望各位，不吝賜教。 |
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ccharlien
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
amisking: 金幣+3, MolEPI+1, 鼓勵積極發(fā)帖幫助解答問題。 2013-01-10 20:28:21
ada800515: 金幣+10, ★★★很有幫助, 謝謝 2013-01-14 09:57:25
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ada800515: 金幣+10, ★★★很有幫助, 謝謝 2013-01-14 09:57:25
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以前做過SNP位點(diǎn)的RFLP，和你的設(shè)計差不多，不過只要PCR--酶切--電泳,就可以看到結(jié)果 你的設(shè)計是基因組--處理--酶切--Realtime PCR，是這個意思么？ 如果酶切之后可以電泳看到條帶差別也就別做定量PCR了，多說明不了什么問題 我覺得如果要做的話，開始試驗(yàn)時設(shè)計一個管家基因比如GAPDH和一個你這個基因的其他片斷做對照就行了 |
2樓2013-01-10 17:52:50
ccharlien
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您好，請問為什么基因組DNA酶切看不出差別？我其實(shí)不是想看酶切后PCR產(chǎn)物的“有”或者“無"，我是想看不同刺激下樣品間的差異。由于基因組是多個細(xì)胞的基因組的混合，real time PCR 后從中可以看到量上的差別吧，這不就體現(xiàn)了不同刺激下，樣品之間的差別了嗎？我以前有做普通PCR，但是看不出量上的差別，所以想用更加靈敏的real time PCR 您提到的設(shè)計GAPDH做對照，是不是設(shè)計GAPDH基因組DNA的引物，然后以此作為內(nèi)參，像做RT-qPCR那樣，用2-△△CT法計算呢？還是需要做絕對定量嗎？ 還望繼續(xù)指導(dǎo)。 |
4樓2013-01-11 10:18:48
ccharlien
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5樓2013-01-11 17:49:41
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