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請教real time pcr問題，謝謝！
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各位大蝦們，小弟想咨詢一些熒光定量的問題，如下： 1. RNA提取后，必須要測濃度嗎，要根據(jù)濃度來決定加入多少ul的rna嗎？ 2. 假如cDNA中還有DNA污染，該怎么辦？能在cDNA中加入DNAseI除去DNA嗎，這回切割cDNA嗎？ 3. 我的模板稀釋了四個(gè)梯度（5,25,125,625）選用18s做內(nèi)參，結(jié)果CT值很大，都在30以上，后來調(diào)整了預(yù)變性時(shí)間，從5min增加到10min，CT值降為24左右，但是這對于內(nèi)參基因來講，仍然很大。我的目的基因CT值都在32-33以上。請問這是怎么回事？我的RNA用盒子提的，效果不錯(cuò)。反轉(zhuǎn)錄用的promega的m-mlv，用ologodt15（50uM）做引物。 4. 我有個(gè)同學(xué)做逆境，相同稀釋倍數(shù)時(shí)，干旱處理時(shí)內(nèi)參18S的CT在10左右，但做鹽脅迫時(shí)相同18S的CT值竟然都在25左右，后來測了一下模板濃度， 都在1000-1300ng左右，感覺差不多呀，聽一個(gè)師姐說做不同的逆境，可能需要不同的引物，請問這是怎么回事呢？ 小弟最近一直很迷茫，不敢輕易再上ABI7500去嘗試了，因?yàn)椴牧嫌邢�，模板有限，不敢輕易得瑟模板。請各位大蝦給予解答！謝謝！ |
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西瓜
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【答案】應(yīng)助回帖
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dhd997(金幣+6, EPI+1): 夠熱心夠辛苦 2011-07-09 08:03:44
dhd997(金幣+6, EPI+1): 夠熱心夠辛苦 2011-07-09 08:03:44
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您說得沒錯(cuò)，內(nèi)參基因就是為了消除模板量差異的，不過調(diào)整到同樣的濃度，擴(kuò)增曲線會(huì)更好看（內(nèi)參基因的曲線幾乎重合）。而且還有一個(gè)作用，那就是檢驗(yàn)這次PCR是否可靠：模板量一樣的話，理論上內(nèi)參基因的Ct值應(yīng)該都差不多，如果出現(xiàn)Ct值偏差很大的情況，那就有問題了。 我有一次摸索某樣品的熒光定量PCR條件，實(shí)驗(yàn)室以前沒人做過（注明：我是直接用的基因組DNA進(jìn)行定量）。第一次做，內(nèi)參基因的Ct值差異很大（用同樣量的DNA），后面改進(jìn)了樣品DNA的提取方法，之后不同樣品間內(nèi)參基因的Ct值就很一致了�？赡芮懊娌襟E導(dǎo)致了DNA的損失，或是有PCR反應(yīng)的抑制劑吧。 試想假如我當(dāng)時(shí)模板量用的不是一樣的，那我就不能發(fā)現(xiàn)DNA提取方法需要改進(jìn)，那么我得到的結(jié)果就很值得懷疑了。 我見過有實(shí)驗(yàn)室要求他們的學(xué)生，不同內(nèi)參基因的Ct必須做到一致（SD<0.2還是多少），挺變態(tài)的，我?guī)熜秩ニ麄兡亲鰧?shí)驗(yàn)都被折磨瘋了：不斷調(diào)樣品濃度，但總也沒法讓內(nèi)參Ct值的差異符合要求……一般實(shí)驗(yàn)室都只要求模板量用一樣的即可，內(nèi)參基因Ct值不要差太多，這種結(jié)果就接受了。像前面提到的實(shí)驗(yàn)室那樣，通過調(diào)整模板濃度來使得內(nèi)參一致，我覺得倒挺有造假嫌疑的。 您的情況，我覺得看您是否對自己的結(jié)果有自信了。我具的自己的例子，是一個(gè)特例：提取步驟里有能抑制酶活的成分，故Ct值差異引起了我對提取步驟的懷疑（畢竟是自己摸索，想得比較多）。如果您的一整套方法都很成熟了，那么內(nèi)參出問題的可能性就很小，這樣的結(jié)果是可靠的。畢竟，當(dāng)初引入內(nèi)參，為的就是消除模板量的差異，內(nèi)參沒出問題，那么模板量用的不一樣也沒關(guān)系。 前面那個(gè)“變態(tài)”的實(shí)驗(yàn)室，他們發(fā)表的結(jié)果里需要有擴(kuò)增曲線的圖，不得不把圖做得“漂亮”些。您的情況，我估計(jì)就放上最終定量的結(jié)果就可以了吧？不是專門研究定量技術(shù)的倒是沒必要把擴(kuò)增曲線圖和Ct值這些放上去，那么內(nèi)參Ct值有點(diǎn)差異倒不會(huì)影響文章發(fā)表。 其實(shí)，熒光定量PCR是一個(gè)精確的定量實(shí)驗(yàn)，我們后面費(fèi)那么大勁，為什么不在一開始就做好“定量”呢？您說是不？ |
6樓2011-07-07 19:31:14
西瓜
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【答案】應(yīng)助回帖
amisking(EPI+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-07 18:30:50
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3. Ct值跟預(yù)變性時(shí)間關(guān)系不大。你的情況是模板濃度太低了。連稀釋5倍Ct值都那么大，那起始的RNA量太少了。下次測了RNA濃度，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒允許使用的RNA最大量來做反轉(zhuǎn)錄。之后梯度稀釋（一般10倍一個(gè)梯度）再做熒光定量PCR。這個(gè)算是預(yù)實(shí)驗(yàn)，要解決的問題是模板該用多少ul。 4.如果內(nèi)參隨處理不同而變化的話，那不是個(gè)好內(nèi)參啊。好的內(nèi)參基因，不管如何處理，只要模板量一樣，它的Ct值就應(yīng)該差不多。不知道你師姐說的用不同引物是不是指用不同的內(nèi)參基因，這方面還是問問你師姐吧�？梢宰鰞�(nèi)參的基因很多，actin、GAPDH、tublin等等，如果18s確實(shí)有這樣的變化，建議你還是查查文獻(xiàn)，換其他內(nèi)參。 一家之言，僅供參考，歡迎各位同行指正哈  |
3樓2011-07-07 09:28:59
西瓜
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【答案】應(yīng)助回帖
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dhd997(金幣+5): 趕快續(xù)，EPI等著你 2011-07-07 07:45:11
billy8580(金幣+1): 不錯(cuò)，分析的詳細(xì) 2011-07-10 00:40:53
dhd997(金幣+5): 趕快續(xù)，EPI等著你 2011-07-07 07:45:11
billy8580(金幣+1): 不錯(cuò)，分析的詳細(xì) 2011-07-10 00:40:53
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1.需要測濃度的，理由：（1）不同的樣品，用的RNA量一樣（cDNA量也一樣），定量結(jié)果更可靠。雖然內(nèi)參可以校正樣品量的差異，但是起始RNA量一樣的話，結(jié)果更可靠，也更漂亮（理想情況是各個(gè)不同樣品內(nèi)參的Ct值非常接近）；（2）反轉(zhuǎn)錄酶能力不是無限的，說明書上都有說RNA的最大加入量，所以需要預(yù)先知道RNA濃度；（3）保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。 2.DNA酶也會(huì)降解cDNA。不過可以用DNA酶處理RNA，之后滅活DNA酶（一般就是酚氯仿抽提），再做反轉(zhuǎn)錄。但是這樣RNA的量損失很大，你樣品少的話不推薦這樣。當(dāng)然通過引物設(shè)計(jì)，跨內(nèi)含子，可以避免基因組DNA的擴(kuò)增，不過引物有時(shí)候很難設(shè)計(jì)。最好的辦法，還是好好提你的RNA，特別是加氯仿抽提之后取上清時(shí)，不要貪多，這樣就能避免基因組DNA的污染了。再說了，你用試劑盒提的，如果還有基因組DNA污染，那就是操作不當(dāng)啦。你樣品寶貴，可以用其他材料，專門練練RNA提取。 （老婆逼睡覺，未完待續(xù)） |
2樓2011-07-07 02:13:23
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-07 18:30:59
amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-07 18:30:59
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1.最還把RNA稀釋到一個(gè)濃度，然后做反轉(zhuǎn)錄，盡力把所有的條件都統(tǒng)一到一個(gè)水平，這樣做出來的結(jié)果會(huì)更可靠 2.做定量的時(shí)候確實(shí)要考慮基因組DNA污染的問題，如果你不想取出gDNA的話，那就在設(shè)計(jì)引物上下功夫，引物跨內(nèi)含子的話，就可以排除gDNA的影響�；蛘�，可以再反轉(zhuǎn)錄前取出基因組DNA，Takara公司有這種反轉(zhuǎn)錄試劑盒，在RT之前加一步gDNA去除的步驟，效果還可以，我就是用的這個(gè)試劑盒，挺好的。 |
4樓2011-07-07 16:17:54
5樓2011-07-07 18:46:39
7樓2011-07-08 21:06:12
8樓2011-07-08 21:18:00
chenguestc
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