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[求助]
請教real time pcr問題，謝謝！
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各位大蝦們，小弟想咨詢一些熒光定量的問題，如下： 1. RNA提取后，必須要測濃度嗎，要根據(jù)濃度來決定加入多少ul的rna嗎？ 2. 假如cDNA中還有DNA污染，該怎么辦？能在cDNA中加入DNAseI除去DNA嗎，這回切割cDNA嗎？ 3. 我的模板稀釋了四個梯度（5,25,125,625）選用18s做內(nèi)參，結(jié)果CT值很大，都在30以上，后來調(diào)整了預變性時間，從5min增加到10min，CT值降為24左右，但是這對于內(nèi)參基因來講，仍然很大。我的目的基因CT值都在32-33以上。請問這是怎么回事？我的RNA用盒子提的，效果不錯。反轉(zhuǎn)錄用的promega的m-mlv，用ologodt15（50uM）做引物。 4. 我有個同學做逆境，相同稀釋倍數(shù)時，干旱處理時內(nèi)參18S的CT在10左右，但做鹽脅迫時相同18S的CT值竟然都在25左右，后來測了一下模板濃度， 都在1000-1300ng左右，感覺差不多呀，聽一個師姐說做不同的逆境，可能需要不同的引物，請問這是怎么回事呢？ 小弟最近一直很迷茫，不敢輕易再上ABI7500去嘗試了，因為材料有限，模板有限，不敢輕易得瑟模板。請各位大蝦給予解答！謝謝！ |
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5樓2011-07-07 18:46:39
西瓜
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5): 趕快續(xù)，EPI等著你 2011-07-07 07:45:11
billy8580(金幣+1): 不錯，分析的詳細 2011-07-10 00:40:53
dhd997(金幣+5): 趕快續(xù)，EPI等著你 2011-07-07 07:45:11
billy8580(金幣+1): 不錯，分析的詳細 2011-07-10 00:40:53
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1.需要測濃度的，理由：（1）不同的樣品，用的RNA量一樣（cDNA量也一樣），定量結(jié)果更可靠。雖然內(nèi)參可以校正樣品量的差異，但是起始RNA量一樣的話，結(jié)果更可靠，也更漂亮（理想情況是各個不同樣品內(nèi)參的Ct值非常接近）；（2）反轉(zhuǎn)錄酶能力不是無限的，說明書上都有說RNA的最大加入量，所以需要預先知道RNA濃度；（3）保證實驗的可重復性。 2.DNA酶也會降解cDNA。不過可以用DNA酶處理RNA，之后滅活DNA酶（一般就是酚氯仿抽提），再做反轉(zhuǎn)錄。但是這樣RNA的量損失很大，你樣品少的話不推薦這樣。當然通過引物設(shè)計，跨內(nèi)含子，可以避免基因組DNA的擴增，不過引物有時候很難設(shè)計。最好的辦法，還是好好提你的RNA，特別是加氯仿抽提之后取上清時，不要貪多，這樣就能避免基因組DNA的污染了。再說了，你用試劑盒提的，如果還有基因組DNA污染，那就是操作不當啦。你樣品寶貴，可以用其他材料，專門練練RNA提取。 （老婆逼睡覺，未完待續(xù)） |
2樓2011-07-07 02:13:23
西瓜
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【答案】應(yīng)助回帖
amisking(EPI+1): 鼓勵應(yīng)助 2011-07-07 18:30:50
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3. Ct值跟預變性時間關(guān)系不大。你的情況是模板濃度太低了。連稀釋5倍Ct值都那么大，那起始的RNA量太少了。下次測了RNA濃度，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒允許使用的RNA最大量來做反轉(zhuǎn)錄。之后梯度稀釋（一般10倍一個梯度）再做熒光定量PCR。這個算是預實驗，要解決的問題是模板該用多少ul。 4.如果內(nèi)參隨處理不同而變化的話，那不是個好內(nèi)參啊。好的內(nèi)參基因，不管如何處理，只要模板量一樣，它的Ct值就應(yīng)該差不多。不知道你師姐說的用不同引物是不是指用不同的內(nèi)參基因，這方面還是問問你師姐吧�？梢宰鰞�(nèi)參的基因很多，actin、GAPDH、tublin等等，如果18s確實有這樣的變化，建議你還是查查文獻，換其他內(nèi)參。 一家之言，僅供參考，歡迎各位同行指正哈  |
3樓2011-07-07 09:28:59
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵應(yīng)助 2011-07-07 18:30:59
amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵應(yīng)助 2011-07-07 18:30:59
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1.最還把RNA稀釋到一個濃度，然后做反轉(zhuǎn)錄，盡力把所有的條件都統(tǒng)一到一個水平，這樣做出來的結(jié)果會更可靠 2.做定量的時候確實要考慮基因組DNA污染的問題，如果你不想取出gDNA的話，那就在設(shè)計引物上下功夫，引物跨內(nèi)含子的話，就可以排除gDNA的影響�；蛘�，可以再反轉(zhuǎn)錄前取出基因組DNA，Takara公司有這種反轉(zhuǎn)錄試劑盒，在RT之前加一步gDNA去除的步驟，效果還可以，我就是用的這個試劑盒，挺好的。 |
4樓2011-07-07 16:17:54
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