 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 3267 | 回復(fù): 10 | |||
| 本帖產(chǎn)生 3 個(gè) MolEPI ，點(diǎn)擊這里進(jìn)行查看 | |||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
[求助]
請(qǐng)教real time pcr問(wèn)題，謝謝！
|
|||
|
各位大蝦們，小弟想咨詢一些熒光定量的問(wèn)題，如下： 1. RNA提取后，必須要測(cè)濃度嗎，要根據(jù)濃度來(lái)決定加入多少ul的rna嗎？ 2. 假如cDNA中還有DNA污染，該怎么辦？能在cDNA中加入DNAseI除去DNA嗎，這回切割cDNA嗎？ 3. 我的模板稀釋了四個(gè)梯度（5,25,125,625）選用18s做內(nèi)參，結(jié)果CT值很大，都在30以上，后來(lái)調(diào)整了預(yù)變性時(shí)間，從5min增加到10min，CT值降為24左右，但是這對(duì)于內(nèi)參基因來(lái)講，仍然很大。我的目的基因CT值都在32-33以上。請(qǐng)問(wèn)這是怎么回事？我的RNA用盒子提的，效果不錯(cuò)。反轉(zhuǎn)錄用的promega的m-mlv，用ologodt15（50uM）做引物。 4. 我有個(gè)同學(xué)做逆境，相同稀釋倍數(shù)時(shí)，干旱處理時(shí)內(nèi)參18S的CT在10左右，但做鹽脅迫時(shí)相同18S的CT值竟然都在25左右，后來(lái)測(cè)了一下模板濃度， 都在1000-1300ng左右，感覺(jué)差不多呀，聽(tīng)一個(gè)師姐說(shuō)做不同的逆境，可能需要不同的引物，請(qǐng)問(wèn)這是怎么回事呢？ 小弟最近一直很迷茫，不敢輕易再上ABI7500去嘗試了，因?yàn)椴牧嫌邢蓿０逵邢�，不敢輕易得瑟模板。請(qǐng)各位大蝦給予解答！謝謝！ |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 【分子生物】EPI帖 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
薇甫飛翔» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有72人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- DGGE引物，real-time PCR引物和 clone library引物 的轉(zhuǎn)化問(wèn)題
已經(jīng)有8人回復(fù)
- real time PCR能測(cè)定基因組內(nèi)某一基因的拷貝數(shù)嗎？
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 關(guān)于real-time PCR溫度優(yōu)化的問(wèn)題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】?jī)?nèi)參照條帶分子量大小與預(yù)期不符
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】real time PCR如何去掉雜峰
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于real time PCR 的問(wèn)題！
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 【求助/交流】Real time PCR 熔點(diǎn)曲線求助，謝謝
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 【求助/交流】RT-real time pcr問(wèn)題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】Real time RT-PCR 引物設(shè)計(jì)問(wèn)題（高懸賞請(qǐng)高手幫忙）
已經(jīng)有28人回復(fù)
- 【求助】請(qǐng)教一下用鴨子做過(guò)實(shí)驗(yàn)的大蝦
已經(jīng)有21人回復(fù)
西瓜
榮譽(yù)版主 (知名作家)
- MolEPI: 50
- 應(yīng)助: 94 (初中生)
- 貴賓: 3.157
- 金幣: 1849.6
- 散金: 11458
- 紅花: 116
- 沙發(fā): 21
- 帖子: 7553
- 在線: 1449.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 271749
- 注冊(cè): 2006-08-13
- 性別: GG
- 專業(yè): 細(xì)胞衰老
- 管轄: 分子生物
【答案】應(yīng)助回帖
amisking(EPI+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-07 18:30:50
|
3. Ct值跟預(yù)變性時(shí)間關(guān)系不大。你的情況是模板濃度太低了。連稀釋5倍Ct值都那么大，那起始的RNA量太少了。下次測(cè)了RNA濃度，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒允許使用的RNA最大量來(lái)做反轉(zhuǎn)錄。之后梯度稀釋（一般10倍一個(gè)梯度）再做熒光定量PCR。這個(gè)算是預(yù)實(shí)驗(yàn)，要解決的問(wèn)題是模板該用多少ul。 4.如果內(nèi)參隨處理不同而變化的話，那不是個(gè)好內(nèi)參啊。好的內(nèi)參基因，不管如何處理，只要模板量一樣，它的Ct值就應(yīng)該差不多。不知道你師姐說(shuō)的用不同引物是不是指用不同的內(nèi)參基因，這方面還是問(wèn)問(wèn)你師姐吧�？梢宰鰞�(nèi)參的基因很多，actin、GAPDH、tublin等等，如果18s確實(shí)有這樣的變化，建議你還是查查文獻(xiàn)，換其他內(nèi)參。 一家之言，僅供參考，歡迎各位同行指正哈  |
3樓2011-07-07 09:28:59
西瓜
榮譽(yù)版主 (知名作家)
- MolEPI: 50
- 應(yīng)助: 94 (初中生)
- 貴賓: 3.157
- 金幣: 1849.6
- 散金: 11458
- 紅花: 116
- 沙發(fā): 21
- 帖子: 7553
- 在線: 1449.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 271749
- 注冊(cè): 2006-08-13
- 性別: GG
- 專業(yè): 細(xì)胞衰老
- 管轄: 分子生物
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5): 趕快續(xù)，EPI等著你 2011-07-07 07:45:11
billy8580(金幣+1): 不錯(cuò)，分析的詳細(xì) 2011-07-10 00:40:53
dhd997(金幣+5): 趕快續(xù)，EPI等著你 2011-07-07 07:45:11
billy8580(金幣+1): 不錯(cuò)，分析的詳細(xì) 2011-07-10 00:40:53
|
1.需要測(cè)濃度的，理由：（1）不同的樣品，用的RNA量一樣（cDNA量也一樣），定量結(jié)果更可靠。雖然內(nèi)參可以校正樣品量的差異，但是起始RNA量一樣的話，結(jié)果更可靠，也更漂亮（理想情況是各個(gè)不同樣品內(nèi)參的Ct值非常接近）；（2）反轉(zhuǎn)錄酶能力不是無(wú)限的，說(shuō)明書上都有說(shuō)RNA的最大加入量，所以需要預(yù)先知道RNA濃度；（3）保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。 2.DNA酶也會(huì)降解cDNA。不過(guò)可以用DNA酶處理RNA，之后滅活DNA酶（一般就是酚氯仿抽提），再做反轉(zhuǎn)錄。但是這樣RNA的量損失很大，你樣品少的話不推薦這樣。當(dāng)然通過(guò)引物設(shè)計(jì)，跨內(nèi)含子，可以避免基因組DNA的擴(kuò)增，不過(guò)引物有時(shí)候很難設(shè)計(jì)。最好的辦法，還是好好提你的RNA，特別是加氯仿抽提之后取上清時(shí)，不要貪多，這樣就能避免基因組DNA的污染了。再說(shuō)了，你用試劑盒提的，如果還有基因組DNA污染，那就是操作不當(dāng)啦。你樣品寶貴，可以用其他材料，專門練練RNA提取。 （老婆逼睡覺(jué)，未完待續(xù)） |
2樓2011-07-07 02:13:23
倔強(qiáng)的投手
新蟲(chóng) (小有名氣)
- MolEPI: 1
- 應(yīng)助: 5 (幼兒園)
- 金幣: 953.9
- 散金: 50
- 紅花: 1
- 帖子: 185
- 在線: 39.7小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1210386
- 注冊(cè): 2011-02-23
- 專業(yè): 畜牧學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-07 18:30:59
amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-07 18:30:59
|
1.最還把RNA稀釋到一個(gè)濃度，然后做反轉(zhuǎn)錄，盡力把所有的條件都統(tǒng)一到一個(gè)水平，這樣做出來(lái)的結(jié)果會(huì)更可靠 2.做定量的時(shí)候確實(shí)要考慮基因組DNA污染的問(wèn)題，如果你不想取出gDNA的話，那就在設(shè)計(jì)引物上下功夫，引物跨內(nèi)含子的話，就可以排除gDNA的影響�；蛘�，可以再反轉(zhuǎn)錄前取出基因組DNA，Takara公司有這種反轉(zhuǎn)錄試劑盒，在RT之前加一步gDNA去除的步驟，效果還可以，我就是用的這個(gè)試劑盒，挺好的。 |
4樓2011-07-07 16:17:54
5樓2011-07-07 18:46:39
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 招08考數(shù)學(xué) +3 | laoshidan 2026-03-20 | 7/350 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 354求調(diào)劑 +7 | Tyoumou 2026-03-18 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 資源與環(huán)境 調(diào)劑申請(qǐng)(333分) +5 | holy J 2026-03-21 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 【考研調(diào)劑】化學(xué)專業(yè) 281分，一志愿四川大學(xué)，誠(chéng)心求調(diào)劑 +11 | 吃吃吃才有意義 2026-03-19 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 材料學(xué)碩333求調(diào)劑 +3 | 北道巷 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)297求調(diào)劑 +3 | Daisy☆ 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +5 | shxchem 2026-03-20 | 7/350 |
|
|
|
[基金申請(qǐng)]
學(xué)校已經(jīng)提交到NSFC，還能修改嗎？
 40+4
|
babangida 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 279求調(diào)劑 +5 | 紅衣隱官 2026-03-21 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 346求調(diào)劑[0856] +4 | WayneLim327 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 310求調(diào)劑 +3 | baibai1314 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +3 | wyyyqx 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料工程（專）一志愿985 初試335求調(diào)劑 +3 | hiloiy 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 二本跨考鄭大材料306英一數(shù)二 +3 | z1z2z3879 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 332求調(diào)劑 +4 | ydfyh 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿華中科技大學(xué)，080502，354分求調(diào)劑 +5 | 守候夕陽(yáng)CF 2026-03-18 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 08工學(xué)調(diào)劑 +5 | 用戶573181 2026-03-20 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085410人工智能專碩317求調(diào)劑（0854都可以） +4 | xbxudjdn 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工調(diào)劑 324分 +10 | llllkkkhh 2026-03-18 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 本科鄭州大學(xué)物理學(xué)院，一志愿華科070200學(xué)碩，346求調(diào)劑 +4 | 我不是一根蔥 2026-03-18 | 4/200 |
|