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[交流] 關(guān)于GatewayBP反應(yīng)的很多問題——?jiǎng)跓└魑慌Ｈ?

最近我一直在做Gateway入門載體BP反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)一些問題。
1.BP反應(yīng)前需要設(shè)計(jì)一段加接頭的基因特異性引物做全長(zhǎng)基因pcr擴(kuò)增，接頭序列讓我很捉摸不透。師兄告訴我
上游引物前附加：5'-3': GGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGA
下游引物前附加：5'-3': GGCGGCCGCACAACTTTGTACAAGAAAGTTGGGTA
可是我發(fā)現(xiàn)這跟官方說明書Gatewayman上面的attB PCR Primers序列不一樣，我是菜鳥，真的不明白怎么回事，這對(duì)后面的BP反應(yīng)有影響嗎。
2.這兩天做了BP反應(yīng)連接轉(zhuǎn)化，挑斑（過夜連接，每個(gè)平板大約10幾20個(gè)斑，很少），然后菌落PCR（M13引物）發(fā)現(xiàn)5個(gè)基因的電泳條帶基本上完全一致，700-800bp左右，而我的5個(gè)基因應(yīng)該是1500bp左右，我捉摸著是不是都是空載體。會(huì)不會(huì)是都沒連接上，也不知道是哪出了問題，用高保真酶擴(kuò)基因全長(zhǎng)條帶都很單一也是目的片段，就是不知道為什么會(huì)這樣，各位大俠牛人教教小女子吧�。�

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1樓 2013-07-21 16:49:02

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lastpython

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7樓2013-07-22 00:21:19

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8樓2013-07-22 00:23:19

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heibi

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9樓2013-07-22 00:23:23

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12樓2013-07-22 04:18:08

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Sthunder

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首先，你所用的引物與我所用的有所出入，我用的是：
F 5’ GGGG ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC
R 5’ GGGG ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT C
其次，BP不是連接哈，他是轉(zhuǎn)換，無論BP OR LR對(duì)其濃度要求比較高，請(qǐng)嚴(yán)格按照其說明書要求進(jìn)行，尤其是BP中的PCR產(chǎn)物濃度，LR中的pZeo濃度。
針對(duì)你的情況，建議做個(gè)酶切驗(yàn)證，挑取BP產(chǎn)物單克隆，提個(gè)質(zhì)粒，然后用Mlu I 做個(gè)酶切看看。

Good luck！

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13樓2013-07-22 08:34:45

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starseacow

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我用的是
attB1 ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct
attB2 ggggaccactttgtacaagaaagctgggt

但樓主的引物沒什么問題，有完整的BP作用位點(diǎn)。對(duì)于正常BP反應(yīng)，如果你的感受態(tài)細(xì)胞沒有問題，可以長(zhǎng)出成百上千個(gè)菌落，只有十幾二十個(gè)菌落很顯然有問題。樓主所用的載體濃度是多少?BP反應(yīng)用的是什么載體？抗性是否選擇正確？

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15樓2013-07-22 18:07:46

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15樓: Originally posted by starseacow at 2013-07-22 18:07:46
我用的是
attB1 ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct
attB2 ggggaccactttgtacaagaaagctgggt

但樓主的引物沒什么問題，有完整的BP作用位點(diǎn)。對(duì)于正常BP反應(yīng)，如果你的感受態(tài)細(xì)胞沒有問題，可以長(zhǎng)出成百上千個(gè)菌落，只 ...

我的BP反應(yīng)用的是PDONR221，濃度200ng左右，抗性應(yīng)該沒錯(cuò)都是抗卡那的。昨天測(cè)序結(jié)果出來了，雖然斑長(zhǎng)得很少，但確實(shí)有目的片段已經(jīng)連上載體了，還算慶幸。還有就是剛才大俠說的BP作用位點(diǎn)是什么呢，我看gateway的說明書也不太明白，有的師兄告訴我，我的引物結(jié)頭不一樣是沒有關(guān)系的說什么gateway載體版本的問題，我都暈了，本來就不太懂的

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benita1995

19樓2013-07-25 10:22:58

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引用回帖:

錯(cuò)了，我說的濃度是載體濃度，pcr產(chǎn)物濃度不高，都是不到100ng

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20樓2013-07-25 10:24:34

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benita1995

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19樓: Originally posted by zhenglingyu at 2013-07-25 10:22:58
我的BP反應(yīng)用的是PDONR221，濃度200ng左右，抗性應(yīng)該沒錯(cuò)都是抗卡那的。昨天測(cè)序結(jié)果出來了，雖然斑長(zhǎng)得很少，但確實(shí)有目的片段已經(jīng)連上載體了，還算慶幸。還有就是剛才大俠說的BP作用位點(diǎn)是什么呢，我看gateway的 ...

你好，我做gateway連接遇到問題了，看到您帖子上說，BP反應(yīng)后用得抗性是kana,不是zeo嗎？

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22樓2016-03-15 15:34:00

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院里的棗

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引用回帖:

樓主的問題解決了嗎，我做bp反應(yīng)也遇到了類似問題，克隆30個(gè)基因的啟動(dòng)子，做完bp反應(yīng)后，pcr驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)假陽性特別高，基本沒有，目的片段本來是差不多都是2000左右，用m13通用引物擴(kuò)增，片段很多都小于500，怎么辦，載體也換過試了，基因也重新克隆了，同樣的問題，生無可戀了，期待樓主答復(fù)

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23樓2016-10-30 22:57:56

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簡(jiǎn)單回復(fù)

yingying15882樓

2013-07-21 23:11 回復(fù)

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天涯20123樓

2013-07-21 23:28 回復(fù)

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xiejf4樓

2013-07-21 23:29 回復(fù)

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miaojiabing5樓

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lefantian1226樓

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syhorchid10樓

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祝福

Superballman11樓

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xianfeng289514樓

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qqaoqq16樓

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qqllqq17樓

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neu23418樓

2013-07-25 10:15 回復(fù)

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yingying158821樓

2013-07-28 20:46 回復(fù)

nono200924樓

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