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sars37

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[求助] 最近做回收膠濃度低，請大家來看看我的實驗步驟是不是有問題。

1 制備1%濃度未加EB的瓊脂糖凝膠，大孔膠。將目的基因產(chǎn)物20μL加入孔中，若有多個目的基因，中間要空一個上樣孔。
2 電泳結(jié)束后，放入EB染色液中染色10min。
3 在紫外燈下將目的條帶切下，盡量不要切到多余的膠。將切下的目的條帶的膠放入1.5ml EP管中。
4 空管事先稱好重量，裝膠后稱重，得出膠重，按照QIANGEN試劑盒說明，提取目的基因。
5 目的基因片段在100—1000bp之間，加入三倍體積QXI試劑，即膠重0.1g，則QXI加0.3ml。
6 加入QXII試劑10ul，振蕩30s。QXII在加樣之前要充分振蕩。
7 將加好樣的EP管放入50℃水浴鍋中，以溶解膠結(jié)合DNA，總共10min。需要每2min振蕩1次，共5次。并觀察顏色是否仍為黃色。
8 室溫離心，13000rpm，30s，槍吸掉上清液。
9 加500μLQXI buffer 清洗，振蕩，離心，室溫，13000rpm，30s。槍吸掉上清液。
10 加500μL PE buffer 清洗，振蕩，離心，室溫，13000rpm，30s。槍吸掉上清液。
11 重復(fù)用 PE buffer清洗一次。吸凈上清液，室溫干燥至沉淀變白。
12 加15μL 滅菌ddH2O，振蕩，混勻，室溫放置5min。
13 離心，室溫，13000rpm，30s，將上清移至新管中，即得提純的目的基因.
再請教一下，如果要回收膠的話，做膠的TBE需要用EDTA調(diào)PH嗎？
還有一個問題是，T4連接之后，在轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞之前，是不是要有一個酒精沉淀DNA的步驟？

[ Last edited by sars37 on 2013-7-24 at 15:19 ]

回復(fù)此樓

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