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wooarcher鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
質(zhì)粒抽提
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我想知道質(zhì)粒抽提試劑盒里各個試劑的成分及作用，不知道有木有人知道啊。。。。。。 |
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 分子生化實驗經(jīng)驗積累 |
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2樓2013-07-24 17:27:34
3樓2013-07-24 19:18:30
lxj341401
至尊木蟲 (著名寫手)
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wooarcher: 金幣+3, ★★★★★最佳答案 2013-08-05 23:19:25
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看看復(fù)旦大學(xué)黃偉達的“從質(zhì)粒提取談起”，你就什么都清楚了。 堿裂解法從大腸桿菌制備質(zhì)粒，是從事分子生物學(xué)研究的實驗室每天都要用的常規(guī)技術(shù)�？梢晕沂昭芯可畮啄炅�，幾乎毫無例外的是我那些給人感覺什么都知道的優(yōu)秀學(xué)生卻對堿法質(zhì)粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因為《分子克隆》里面只講實驗操作步驟，而沒有對原理進行詳細的論述。這是導(dǎo)致我的學(xué)生誤入歧途的主要原因。后來我發(fā)現(xiàn)其實是整個中國的相關(guān)領(lǐng)域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老師”也是這個狀態(tài)。這就不得不讓人感到悲哀了。 我想這恐怕和我們的文化有點關(guān)系。中國人崇尚讀書，“學(xué)而優(yōu)則仕”的觀念深入人心。經(jīng)常聽到的是父母對他們的獨苗說，你只要專心讀好書就可以了。所以這讀書的定義就是將教課書上的東西記住，考試的時候能拿高分……這就是現(xiàn)代科學(xué)沒有在中國萌發(fā)的根本原因。如果中國文化在這一點上不發(fā)生變化，那么科學(xué)是不能在中國真正扎根的，它只能蛻化成新的“八股學(xué)”。 生命科學(xué)是實驗科學(xué)，它講究動手。如果實驗科學(xué)只要看看書就可以了，那我想問有那位神仙看看書就會騎自行車了？或者聽聽體育老師的講解就會滑冰了？ 可是光動手不思考，不就成了一個工匠？一個合格的生命科學(xué)研究者，需要在這兩方面完善自己。一個杰出的科學(xué)工作者，是一個熟知科學(xué)原理并善于應(yīng)用的“藝術(shù)家”。 每個曾經(jīng)用堿法抽提過質(zhì)粒的同學(xué)，希望你看本文后能有所思考，讓中國的未來有希望。 為了方便理解，這里羅列一下堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M醋酸鉀/ 2 M醋酸。 讓我們先來看看溶液I的作用。任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的p H，因此用適當濃度的和適當pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？說起來不可思議，加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達10 mM的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為最終溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA.如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實話告訴你，只要用等體積的水，或LB培養(yǎng)基來懸浮菌體就可以了。有一點不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。 輪到溶液II了。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2%的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因為 SDS也是堿性的，只是弱了點而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對待女孩子一樣），不然基因組DNA也會斷裂。基因組DNA的斷裂會帶來麻煩，后面我再詳細說明。 每個人都知道，溶液III加入后就會有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。 最容易產(chǎn)生的誤解是，當SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質(zhì)。既然 SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate，PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，溶液III加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的納離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個過程不難想象，因為基因組DNA太長了，長長的DNA 自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。那么2 M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷DNA，所以要中和之。基因組DNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50-100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉淀了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認為是溶液III加入后基因組DNA無法快速復(fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會，因為變性的也好復(fù)性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細胞而用的，DNA分子的變性其實是個副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來其實沒有關(guān)系。溶液 III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點。 不要以為PDS沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了，其實還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進行抽提，然后進行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA，不然時間一長就會因為混入的DNase而發(fā)生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個全面的介紹。酚（Phenol）對蛋白質(zhì)的變性作用遠大于氯仿，按道理應(yīng)該用酚來最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），應(yīng)此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必擔心酶切等反應(yīng)不能正常進行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。 回收后的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來。這時候如果放到-20℃，時間一長反而會導(dǎo)致大量鹽的沉淀，這點不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要過分小心了。高濃度的鹽會水合大量的水分子，因此DNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀，就用70%的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個小時以上，并用tip將沉淀打碎，就能得到好的樣品。得到的質(zhì)粒樣品一般用含 RNase（50 ug/ml）的TE緩沖液進行溶解，不然大量未降解的RNA會干擾電泳結(jié)果的。瓊脂糖電泳進行鑒定質(zhì)粒DNA時，多數(shù)情況下你能看到三條帶，但千萬不要認為你看到的是超螺旋、線性和開環(huán)這三條帶。堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA，不信的話你用EcoRI來線性化質(zhì)粒后再進行瓊脂糖電泳，就會看到線性質(zhì)粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個質(zhì)粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。 非常偶然的是，有時候抽提到的質(zhì)粒會有7-10條帶，這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。這里暫不深究。 |
4樓2013-07-24 19:46:41
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